基于感官导向的香荚兰特征风味物质分析及重构

李瑞丽，田 数，郭春生，李力群，陈 康，梁 淼，张峻松,*

（1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南 郑州 450001；2.内蒙古昆明卷烟有限责任公司，内蒙古 呼和浩特 010020）

香荚兰（Vanilla planifoliaAndrews）属兰科，是典型的热带经济作物，作为重要的香原料，常以浸膏、酊剂、粉末等形式应用于食品、化妆品等领域[1-3]，香兰素被认为是香荚兰提取物最重要的香气成分[4-5]。目前国内外围绕香荚兰的研究主要集中于提取制备工艺[5-11]、提取物挥发性成分的分析方法[12-14]、产地及环境因素对香荚兰成分及感官品质的影响[15-20]等方面。与溶剂浸泡、超声提取相比，微波提取法的香兰素得率相对最高[5]。添加香草芽孢杆菌XY18和枯草芽孢杆菌XY20后香荚兰豆的香兰素含量（3.58%、3.48%）高于非微生物辅助腌制和常规腌制的香荚兰豆（3.09%、3.21%）[8]。Sanchez等[11]采用高压均质法从香荚兰提取物种制备无醇纳米溶液，以提高溶解性和稳定性。

香荚兰提取物作为特色鲜明的天然香原料，已有以香荚兰提取物中含量较高的成分或以不同香荚兰提取物的共有成分作为其特征风味物质的研究报道[13-14]，鉴定出的特征风味物质主要有香兰素、愈创木酚、香草酸、4-羟基苯甲醛、4-羟基苯甲酸等[13-14,21]，在研究体系中，含量较少的成分如果其阈值较低，也可能对特征风味具有重要贡献[22]，因此，仅以含量高低或是否为共有成分确定特征风味物质不够严谨。

天然产物组成虽复杂，但对其风格特征形成和彰显具有决定作用的往往是关键内在成分，感官导向结合组成成分定性定量分析是找出天然产物特征风味物质的重要方法[23-26]。操晓亮等[23]通过感官评价和成分分析鉴定了芳樟醇、橙花叔醇等22 种成分为铁观音茶叶的关键香气物质。闫新焕等[24]通过顶空固相微萃取气相色谱嗅闻质谱技术结合感官分析和统计方法找出3-羟基-2-丁酮、2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮等18 种成分为热风干制红枣的特征香气物质。目前鲜见以感官导向研究香荚兰提取物特征风味物质的相关研究报道。香荚兰特征风味天然香原料在世界范围内早已供不应求[27-28]，以感官导向结合组成成分分析研究香荚兰提取物特征风味物质，旨在为香荚兰特征风味天然香原料的品质稳定性监控提供物质基础，为香荚兰特征风味香原料的复配调制提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海南产香荚兰豆荚 蒙昆香精香料公司；己酸乙酯、乳酸乙酯、糠醛、5-甲基糠醛、乙酰丙酸乙酯、糠醇、丁二酸二乙酯、愈创木酚、2-甲氧基-4-甲基苯酚、苯酚、二氢-3-羟基-4,4-二甲基-2(3H)-呋喃酮、肉桂酸甲酯、4-乙烯基愈创木酚、4-甲氧基苯甲醇、香草醇乙醚、5-羟甲基糠醛、4-(乙氧基甲基)苯酚、香兰素、香草酸乙酯、香草乙酮、高香草酸乙酯、香草醇、丁香醛、4-羟基苯甲醇、4-羟基苯甲醛、异丁酸、异戊酸、丁二酸单乙酯、2-甲基丁酸、4-甲氧基苯甲酸、肉桂酸、香兰酸、乙酸、乳酸、丙酸苏合香酯（标准品） 美国Acros Organics公司；甲醇、乙醇（均为色谱纯） 美国TCI公司；去离子水 中国屈臣氏公司。

1.2 仪器与设备

7890A/5975C气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）联用仪 美国Agilent公司；固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）手柄、SPME萃取纤维头（50/30 μm DVB/CAR/PDMS） 美国Supelco 公司；20 mL 带聚四氟乙烯垫螺纹顶空瓶 美国CNW公司；冷冻干燥机 德国Christ公司；旋转蒸发仪 瑞士Büchi公司；8894型超声仪 美国Cole Parmer公司；Lab Dancer S25涡旋仪 德国IKA公司；CP2245电子天平（感量0.0001 g） 德国Sartorius公司；HH-S1型恒温水浴锅 巩义市予华仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香荚兰提取物的制备

冷浸提取法：取剪碎至1 cm的香荚兰豆荚原料，按照1∶5（g/mL）比例添加体积分数65%的乙醇溶液，常温冷浸3 个月后过滤，得到第1次冷浸滤液，然后分别按照1∶3和1∶2的比例，常温各冷浸1 周后过滤，得到第2和第3次冷浸滤液，合并3 次滤液得到香荚兰豆冷浸提取液，减压蒸馏浓缩至干，即得香荚兰提取物。

1.3.2 香荚兰提取物组成成分分析

样品前处理：1）直接进样法：称取约0.1 g香荚兰提取物样品，加入10 mL甲醇，加塞密封涡旋振荡5 min后，取上清液过0.45 µm有机膜，取1 µL进行GC-MS分析；2）顶空-SPME-GC-MS（headspace-SPME-GC-MS，HS-SPME-GC-MS）前处理：称取约0.5 g香荚兰提取物置于20 mL顶空瓶中，加盖密封，在室温（25 ℃）下，将纤维头预先老化的SPME针头插入顶空瓶中，推出纤维头，顶空吸附50 min后，立即取出SPME针头并插入GC-MS进样口，于250 ℃下热脱附4 min后抽回萃取纤维头，同时GC-MS开始采集数据。

GC条件：DB-5MS色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气：He；恒流模式1.0 mL/min；升温程序：50 ℃保持2 min，以8 ℃/min速率升至280 ℃，保持25 min；分流比15∶1；进样口温度250 ℃；传输线温度280 ℃。

MS条件：电子电离源；电离能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；质量扫描范围50～500 u；溶剂延迟4.8 min。

定性定量分析：根据Wiley12、NIST20质谱库检索，结合保留指数比对，与质谱库中化合物的相似度不足80%的成分定性为未检出。采用内标法建立各化合物的标准曲线进行定量分析。

1.3.3 香荚兰提取物特征成分阈值及香气活性值（odor activity value，OAV）分析

阈值测定：参照GB/T 22366—2008《感官分析 方法学 采用三点选配法（3-AFC）测定嗅觉、味觉和风味觉察阈值的一般导则》中针对最优估计阈值（best estimate threshold，BET）法[29]，组织10 位专业评委组成评价小组，通过3 点法对各成分的嗅觉阈值进行评价，计算10 位评委评价BET值的几何平均值记为该成分的嗅觉阈值。

OAV的计算：OAV为各化合物在提取物中质量浓度（C）与嗅觉阈值（T）的比值，即OAV=C/T。

1.3.4 香荚兰提取物及香气重组样品的感官评价

参照GB/T 10220—2012《感官分析 方法学 总论》[30]，组织10 位专业评委组成感官评价小组，按照嗅香评价标准（表1）对样品进行香气评价，计算10 位评委对样品某香韵赋分的几何平均值记为该样品该香韵指标的得分值。参照文献[31]计算重组样品与香荚兰提取物的感官相似度。

表1 嗅香评价赋分Table 1 Criteria for sensory aroma evaluation

1.4 数据处理

采用Excel 2016以3 次重复的实验均值计算重要香气成分的OAV；采用Origin 9.1绘制香荚兰提取物及关键香气成分重组样品的香气轮廓雷达图。

2 结果与分析

2.1 香荚兰提取物的组成成分

香荚兰提取物样品直接进样和HS-SPME进样的GC-MS定性分析结果分别见表2、3。直接进样法共检出62 种香气成分，HS-SPME-GC-MS法共检出45 种香气成分，与直接进样法相比，HS-SPME-GC-MS获得的挥发性化合物种类相对较少。2 种方法检出的共有成分有24 种，主要是香兰素、愈创木酚、香草醇乙醚、4-甲氧基苯甲醇、4-羟基苯甲醛、糠醛、5-甲基糠醛、苯酚、2-甲氧基-4-甲基苯酚、4-(乙氧基甲基)苯酚等。HS-SPME对沸点较低、挥发性较强的成分更为敏感，与直接进样法形成互补，从香荚兰提取物中共检出83 种香气成分。黎强等[14]利用HS-SPME-GC-MS分析海南、福建、印度尼西亚等产地的香荚兰样品，发现其香气化合物为44～57 种不等，其中，香兰素、愈创木酚、4-甲基愈创木酚、糠醛等香气化合物在不同产地样品中均有检出，这可能是对香荚兰特征风味有重要贡献的香气化合物。

表2 香荚兰提取物样品的GC-MS定性分析结果Table 2 Results of qualitative analysis of aroma components in vanilla extract by GC-MS

续表2

表3 香荚兰提取物的HS-SPME-GC-MS定性分析结果Table 3 Results of qualitative analysis of vanilla extract by HS-SPME-GC-MS

续表3

2.2 香荚兰提取物香韵特征及主要香气成分分析

由图1可知，香荚兰提取物具有明显的奶香、甜香、烟熏香和酸香，并带膏香、焦香、豆香和辛香的香韵特征。香荚兰提取物检出的83 种香气成分中，以香荚兰提取物感官评价的香韵特征为导向，结合化合物的香气特性，筛选与香荚兰提取物特征风味密切相关的34 种成分。

图1 香荚兰提取物的感官评价Fig.1 Sensory evaluation results of vanilla extract

感官评价小组对34 种化合物标准品在乙醇介质中的嗅香评价结果（表4）表明，香兰素、乳酸乙酯、香草酸乙酯、香草醇乙醚、香草醇、香兰酸、糠醇等11 种化合物具有奶香特征；己酸乙酯、肉桂酸甲酯、乙酰丙酸乙酯、糠醛、5-甲基糠醛、5-羟甲基糠醛、香兰素等16 种化合物具有甜香特征；苯酚、愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚、4-(乙氧基甲基)苯酚等5 种化合物具有烟薰香特征；乙酸、乳酸、异戊酸、异丁酸、丁二酸单乙酯5 种化合物具有酸香特征；肉桂酸、香草醇、4-羟基苯甲醇、4-甲氧基苯甲酸4 种化合物具有膏香特征；糠醛、糠醇、5-甲基糠醛、5-羟甲基糠醛、4-羟基苯甲醛、二氢-3-羟基-4,4-二甲基-2(3H)-呋喃酮、香草酸乙酯等8 种化合物具有焦香特征；香兰素、香草乙酮等化合物具有豆香特征；2-甲氧基-4-甲基苯酚、丁香醛、4-甲氧基苯甲酸等化合物具有辛香特征。多个化合物对同一种香韵特征有贡献，如有16 种化合物具有甜香香韵特征。同一种化合物对多个香韵特征有贡献，如香兰素涵盖奶香、甜香及豆香；综合来看，这些香气成分基本能反映香荚兰提取物的奶香、甜香、烟熏香、酸香、膏香、焦香、豆香及辛香等香韵特征，初判为对香荚兰提取物特征风味有重要贡献的香气成分。

表4 香荚兰提取物中重要成分的香气描述Table 4 Aroma description of important volatile components in vanilla extract

2.3 主要香气成分对香荚兰提取物特征风味的贡献度分析

对复杂天然香原料，检出其成分组成后，需进一步确定各成分对整体风味特征的贡献度大小。OAV是表征贡献度的重要指标，在体系中香气成分的OAV越大，则说明其对风味特征的贡献越大，当香气成分的OAV小于1时，认为其对体系风味的贡献度较小，可以忽略不计。通过比较各香气成分的OAV，找出对香气体系起重要作用的关键成分[14-16]。

由表5可知，香兰素的含量高，阈值低，OAV远高于其他香气成分，是香荚兰特征风味的关键香气物质。这与Pérez-Silva等[32]的研究结果较为一致，香荚兰豆提取物中香草醛的含量远高于愈创木酚等化合物。4-(乙氧基甲基)苯酚、愈创木酚的含量较高，阈值较低，OAV均大于20，对香荚兰特征风味的贡献较大。4-乙烯基愈创木酚的含量较低，但阈值也较低，尤其是异戊酸，含量最低，但其阈值很低，OAV也较高，这些也是对香荚兰特征风味有较大贡献的重要香气成分。综合来看，香兰素、4-(乙氧基甲基)苯酚、愈创木酚、乙酸、4-乙烯基愈创木酚、香草醇乙醚、乳酸乙酯、乳酸、异戊酸、苯酚、4-羟基苯甲醛、2-甲氧基-4-甲基苯酚、4-羟基苯甲醇、香草醇等成分的OAV均大于1，判断其为对香荚兰提取物特征风味有重要贡献的特征香气成分组群。

表5 香荚兰提取物中各主要香气成分的含量、阈值及OAVTable 5 Contents,thresholds and OAVs of major aroma components in vanilla extracts

2.4 基于特征香气组群的香荚兰特征风味重构

香荚兰提取物中香兰素、4-(乙氧基甲基)苯酚、愈创木酚、乙酸、4-乙烯基愈创木酚、香草醇乙醚、乳酸乙酯、乳酸、异戊酸、苯酚、4-羟基苯甲醛、2-甲氧基-4-甲基苯酚、4-羟基苯甲醇、香草醇14 种成分的OAV均大于1，构成了香荚兰提取物的特征香气成分组群。以这些关键香气成分在香荚兰提取物中的自然含量，经归一化处理后进行化学重组。由重组样品及香荚兰提取物样品的感官评价结果（图2）可知，关键香气成分重组样品具有与香荚兰提取物相似的整体香气特征，具有明显的奶香、甜香、烟熏香和酸香等典型特征，香荚兰特征香气风格的辨识度较高。重组样品与香荚兰提取物的感官相似度高达92.33%，说明基于特征香气成分组群可模拟香荚兰提取物的香气特征，同时，也验证了基于OAV找出的香荚兰提取物的特征香气成分组群是香荚兰天然香原料特征风味的物质基础。

图2 关键香气成分重组样品与香荚兰提取物的香气轮廓雷达图Fig.2 Radar chart of aroma profiles of recombination sample of key aroma compounds and vanilla extract

3 结论

香荚兰提取物具有明显的奶香、甜香、烟熏香和酸香的特征香韵，且略带膏香、焦香、豆香和辛香的香韵特征。HS-SPME-GC-MS与直接进样的GC-MS法从香荚兰提取物中共检出83 种香气成分。根据香荚兰提取物香韵特征和各化合物香气特性初判有34 种成分与香荚兰提取物特征风味密切相关，其中，香兰素、4-(乙氧基甲基)苯酚、愈创木酚、乙酸、4-乙烯基愈创木酚、香草醇乙醚等14 种成分的OAV均大于1，尤其是香兰素，OAV远高于其他成分。经香气重组实验验证，14 种关键香气成分的重组样品与香荚兰提取物的感官相似度高，香荚兰特征香气风格辨识度明显，具有香荚兰样的奶香、甜香、烟熏香和酸香等典型的风格特征，且重组样品的整体香势比香荚兰提取物略高。因此，判定香兰素、4-(乙氧基甲基)苯酚、愈创木酚、乙酸、4-乙烯基愈创木酚、香草醇乙醚、乳酸乙酯、乳酸、异戊酸、苯酚、4-羟基苯甲醛、2-甲氧基-4-甲基苯酚、4-羟基苯甲醇、香草醇为香荚兰提取物的特征风味物质。以感官导向结合成分分析明确香荚兰提取物特征风味物质，可为香荚兰特征风味天然香原料的质控提供基础支撑，同时，可为香荚兰特征风味的复配重构提供技术指导，为缓解香荚兰特征风味天然香原料的供需矛盾提供新的解决途径。基于关键风味物质复配调制的香荚兰特征风味香精在烘焙、饮品等不同类型食品中的应用效果仍需进一步实践验证。