鹰嘴豆抗氧化肽的分离纯化、鉴定及其抗氧化活性

梁雪荣，路振康，毛晓英，吴庆智，张 建

（石河子大学食品学院，新疆 石河子 832000）

自由基的过度产生会导致氧化应激，破坏DNA、蛋白质和脂质并中断各种生理功能，引起多种慢性疾病，甚至产生急性氧中毒导致生命危险[1]。此外，过多的自由基会产生氧化作用，这可能会降低食品的质量，缩短食品的保质期[2]。合成抗氧化剂（叔丁基对苯二酚、没食子酸丙酯和丁基羟基茴香醚等）可有效控制食物营养物质的氧化。此外，膳食中摄入的抗氧化剂也可以降低与氧化应激相关的慢性疾病风险[3]。然而，合成抗氧化剂具有损伤DNA和潜在毒性风险的缺点。因此，近年来，从天然来源中寻找新的、安全的抗氧化剂，用于食品和医药材料，以取代合成抗氧化剂，引起了人们极大的兴趣[4]。值得注意的是，源自植物蛋白的天然抗氧化肽因其环保、可持续、无毒副作用等优点而受到广泛关注[5]。近年来，人们从植物蛋白如鹰嘴豆等各种生物资源中鉴定并表征了具有更多营养价值的生物活性肽。

鹰嘴豆（CicerarietinumL.）为豆科（Leguminosae）重要作物，是世界上仅次于大豆和豌豆的第3大重要谷物豆类，主要用作人类食物来源，它是植物蛋白最经济的来源之一[6]。鹰嘴豆蛋白被认为是良好的膳食蛋白质来源，是因为其氨基酸组成平衡、蛋白质生物利用度高[7]。鹰嘴豆蛋白水解物具有多种生物活性，包括抗氧化、抗菌、血管紧张素转换酶抑制和降血脂等[8-9]。学者们通过酶解鹰嘴豆蛋白制备了多种生物活性肽，其中以具有抗氧化活性的肽研究报道较多[5,7]。因此，有关鹰嘴豆抗氧化肽的研究已成为当前一个研究热点。然而，鹰嘴豆的高营养价值通常会受到一些抗营养因子的影响，如胰蛋白酶抑制剂、单宁、植酸和皂苷等[10]。发芽可以改善鹰嘴豆粉的功能特性和鹰嘴豆分离蛋白的抗氧化特性，并显著减少其抗营养因子[11-12]。因此，在这项工作中，以发芽鹰嘴豆为原料，制备了鹰嘴豆抗氧化肽，采用葡聚糖凝胶对其进行分离纯化，通过测定各种自由基清除能力、还原力、脂质氧化抑制能力、对自由基诱导的蛋白质和DNA损伤的保护能力评价纯化肽的抗氧化活性。并且对纯化肽通过鉴定合成验证了其抗氧化活性。最后对抗氧化肽进行安全性预测，为开发具有抗氧化功能的鹰嘴豆抗氧化肽提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鹰嘴豆（卡布里型）产自新疆木垒县；pBR322质粒DNA 上海保藏生物技术中心；牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、碱性蛋白酶（酶活力2.0×105U/g）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、2,2’-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（2,2’-azo-bis(2-methylpropiona mide)-dihydrochloride，AAPH）、Sephadex G-75 北京索莱宝科技有限公司；乙腈、甲醇、甲酸、三氟乙酸（均为色谱纯） 美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DBS-100蛋白质纯化系统 上海青浦沪西分析仪器厂有限公司；高速冷冻离心机 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；多功能酶标仪 美国Thermo 公司；SCIENTZ-18N型真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；L-8900型高速氨基酸分析仪 日本日立有限公司；LC-2010A HT型液相色谱仪 日本岛津公司；毛细管高效液相色谱仪、电喷雾-组合型离子阱Orbitrap质谱仪 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 鹰嘴豆多肽的制备

将挑选好的鹰嘴豆先浸泡12 h，然后在室温下每隔6 h喷水，使其发芽2～3 d，芽长达到2～3 cm左右，制备发芽鹰嘴豆。以发芽鹰嘴豆为原料，采用低温烘干，经高速粉碎机粉碎，过60 目筛，制备发芽鹰嘴豆粉，脱脂后于4 ℃贮存备用。

发芽鹰嘴豆蛋白的制备参考Feng Li等[13]的方法并作修改。将发芽鹰嘴豆粉与水以一定的比例混合，用0.5 mol/L NaOH溶液调节pH值至9，搅拌1 h，4000×g离心10 min，所得沉淀重复提取2 次。将3 次上清液混合，用0.5 mol/L HCl溶液调节pH 4.3，8000×g离心10 min，用蒸馏水洗涤沉淀，并将所得蛋白浆pH值调节至7.0，冷冻干燥48 h即为鹰嘴豆蛋白，-20 ℃贮存备用。

鹰嘴豆多肽的制备参考Yang Jing等[14]的方法并作修改。根据前期实验结果得出，采用碱性蛋白酶按照底物质量浓度2 g/100 mL、酶用量8000 U/g、pH 8.0、温度50 ℃、酶解时间60 min的条件进行酶解，酶解之后，90 ℃水浴10 min进行灭酶，7000×g离心10 min，收集上清液并冷冻干燥，-20 ℃贮存备用。

1.3.2 鹰嘴豆多肽基本成分及氨基酸的测定

水分含量测定：直接干燥法（GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》）；蛋白质含量测定：凯氏定氮法（GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》）；脂肪含量测定：索氏提取法（GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》）；灰分含量测定：灰化法（GB 5009.4—2016《食品中灰分的测定》）。

使用L8900高速氨基酸分析仪进行氨基酸分析。每个样品在110 ℃用密封和真空玻璃管中的6 mol/L HCl溶液水解24 h。消化后的样品定容至25 mL容量瓶。取5 mL消化液于60 ℃干燥，并用醋酸钠缓冲溶液（pH 6.4）稀释。氨基酸组成分析结果以mg/g表示。

1.3.3 凝胶色谱法分离抗氧化肽

抗氧化肽的分离参照Liu Jingbo等[15]的方法，稍作修改。将鹰嘴豆蛋白水解物以30 mg/mL的质量浓度溶解在超纯水中，然后将3 mL样品加入Sephadex G-75柱（1.6 cm×50 cm），用超纯水预平衡。将流速调整为0.5 mL/min，每3.5 min将洗脱液收集到管中，280 nm波长处测定吸光度绘制峰形图。收集出峰组分，冷冻干燥后测定抗氧化活性，并选取活性最高的组分用于后续分析。

1.3.4 鹰嘴豆纯化肽分子质量分布的测定

参照Yu Yihan等[16]的方法，略有修改。使用LC-2010A HT型液相色谱议（配有紫外检测器）；色谱条件：TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm色谱柱；流动相：乙腈-水-三氟乙酸（45∶55∶0.1，V/V）；紫外检测波长220 nm；流速0.5 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 μL。分子质量校正曲线所用标准品（mw）：细胞色素C（12327），抑肽酶（6511），杆菌肽（1421），Gly-Gly-Gly（189）。以标准品的lgmw及洗脱时间作标准曲线（y＝-0.2343x＋6.7213，R2=0.9916）。

1.3.5 纯化肽抗氧化活性的测定

分别参考文献[17-20]的方法测定样品的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、羟自由基清除活性及还原力（A700nm）。

1.3.6 纯化肽脂质氧化抑制能力的测定

根据Wang Jingyun等[21]的方法测定脂质氧化抑制能力，略有改动。亚油酸乳化液配制：0.28 g亚油酸，0.028 g吐温20，用磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 7.2）定容至50 mL。配制不同质量浓度纯化的肽液，并以谷胱甘肽（glutathione，GSH）溶液为对照组。将2.0 mL无水乙醇、5.0 mL亚油酸乳化液、4.0 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液与4.0 mL不同质量浓度肽液或GSH溶液混合。

采用硫氰酸铁法测定过氧化值：0.1 mL混合溶液与体积分数75%的乙醇溶液、0.1 mL硫氰酸铵溶液（30%）、0.1 mL FeCl2溶液（0.02 mol/L；3.5% HCl溶液配制）反应3 min，在500 nm波长处测吸光度，记为A样品0h，间隔144 h后测吸光度，记为A样品144h。空白对照：用去离子水代替肽液重复上述步骤测定吸光度，记为A空白0h，间隔144 h后测吸光度，记为A空白144h。脂质氧化抑制率按下式计算：

1.3.7 纯化肽对AAPH诱导蛋白质损伤的保护能力

参照张亮亮等[22]方法并略作修改。实验组为0.4 mL 5 mg/mL的BSA溶液，加入0.2 mL 80 nmol/L的AAPH作为氧化剂氧化BSA，构建蛋白质氧化体系，加入0.4 mL不同质量浓度（1、3、5 mg/mL）纯化肽液作为抗氧化剂。以BSA加磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 7.2）为空白组，以磷酸盐缓冲液代替抗氧化剂为损伤组。将每组分别混合后，在37 ℃孵育24 h后，用0.02%的2,6-二叔丁基对甲基苯酚加入混合液终止反应。样品通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证。使用软件Quantity One 4.6.2（Bio-Rad，美国）测量BSA条带的相对强度。

1.3.8 纯化肽对羟自由基诱导的DNA损伤的保护作用

参照Wang Jingyun等[21]方法并略作修改。羟自由基由Funton反应生成：取2.5 μL pBR322质粒DNA，依次加入1.25 μL 6 mmol/L FeSO4溶液，1.25 μL 6 mmol/L H2O2溶液，2.5 μL不同质量浓度（1、3、5 mg/mL）纯化肽液在37 ℃孵育30 min，立即加入10×DNA Loading Buffer结束反应。空白组为pBR322质粒DNA加磷酸盐缓冲液（50 mmol/L，pH 7.0），损伤组以磷酸盐缓冲液代替肽液。混合物在1%琼脂糖凝胶上电泳。电泳后，染色30 min，用凝胶成像仪进行成像。软件Quantity One 4.6.2用于测定超螺旋DNA条带的相对强度。

1.3.9 基于液相色谱-串联质谱（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法鉴定抗氧化肽

委托北京百泰派克生物科技有限公司完成其结构鉴定。采用Nanoflow-UPLC（Ultimate 3000系统）色谱仪。色谱条件：纳米柱：150 μm×15 cm自制柱，填充反相ReproSil Pur C18-AQ树脂（1.9 μm，100 Å，Dr.Maisch GmbH，德国）；流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为乙腈（含0.1%甲酸）。梯度洗脱：0～5 min，94%～91% A、6%～9% B；5～20 min，91%～86% A、9%～14% B；20～50 min，86%～70% A、14%～30% B；50～58 min，70%～60% A、30%～40% B；58～60 min，60%～5% A、40%～95% B。流速600 nL/min，进样量5 μL。质谱条件：喷淋电压2.2 kV，毛细管温度270 ℃。

利用Byonic对原始MS文件进行分析，并根据样本种类对目标蛋白数据库进行检索。只有高置信度鉴定肽被选择用于下游蛋白质鉴定分析。

1.3.10 抗氧化肽的合成

委托生工生物工程（上海）股份有限公司用固相肽合成法合成（合成多肽纯度＞95%）。并评估了合成肽的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、羟自由基清除活性及还原力。

1.3.11 抗氧化肽的致敏性与毒性预测

多肽的致敏性预测采用AlgPred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/algpred2/index.html），预测方法基于氨基酸组成的SVM模型；毒性预测采用ToxinPred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/design.php），预测方法基于Swiss-Prot[23]。

1.4 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2.1 鹰嘴豆抗氧化肽基本成分及氨基酸组成

根据前期多肽制备的最佳条件得多肽得率为55.07%，此时，多肽DPPH自由基清除率为43.71%。从表1可以看出，鹰嘴豆多肽含有较高的蛋白质含量和较低的脂肪含量。

表1 鹰嘴豆多肽基本成分Table 1 Basic components of antioxidant peptide derived from chickpea

从表2可以看出，鹰嘴豆多肽中的氨基酸组成合理，富含人体所需的各种必需氨基酸与非必需氨基酸。其中，Glu、Asp、Arg、Leu、Phe以及Lys的含量较高。有研究发现，疏水性氨基酸有着较强的自由基清除能力和抗脂质过氧化能力[24]。从表2可以看出，鹰嘴豆多肽的疏水性氨基酸含量占总氨基酸含量的38%，使鹰嘴豆抗氧化肽具有较强的抗氧化活性。由此推断，鹰嘴豆抗氧化肽表现出较强的抗氧化活性与其氨基酸组成密不可分。

表2 鹰嘴豆多肽氨基酸组成Table 2 Amino acid composition of antioxidant peptide

2.2 抗氧化肽的Sephadex G-75凝胶分离

鹰嘴豆多肽经Sephadex G-75分离后得到的3 个组分（图1A，HCP-1、HCP-2和HCP-3），根据葡聚糖凝胶柱分离原理它们分子质量的大小应为HCP-1＞HCP-2＞HCP-3。由图1B可知，3 个组分均表现了一定的抗氧化活性。组分HCP-3的DPPH自由基、羟自由基以及ABTS 阳离子自由基的清除能力最高，分别为（43.23±0.80）%、（57.38±1.02）%和（96.76±1.00）%，高于未纯化之前鹰嘴豆蛋白水解（（42.91±1.03）%、（42.26±1.20）%、（72.23±1.00）%）。组分HCP-2的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力最差，分别为（36.10±1.80）%和（78.76±0.92）%，而HCP-1的羟自由基清除能力最差，为（42.21±0.47）%。分子质量是影响蛋白质水解物抗氧化活性的重要因素水解物，低分子质量蛋白质水解物或肽更能有效地与自由基发生反应[25]。因此，确定组分HCP-3为进一步研究对象。

图1 鹰嘴豆肽的Sephadex G-75凝胶过滤色谱法（A）和Sephadex G-75凝胶过滤色谱法纯化HCP组分的抗氧化活性（2 mg/mL）（B）Fig.1 Sephadex G-75 gel filtration chromatogram of HCP (A),and free radical scavenging capacity of three HCP fractions (2 mg/mL) (B)

2.3 纯化肽的分子质量分布

由图2和表3可知，鹰嘴豆纯化肽中分子质量低于1200 Da的肽占93.82%，分子质量低于750 Da的肽占76.24%，说明纯化之后得到小分子低聚寡肽含量高。肽段长短与抗氧化能力高低密切相关，分子质量在500～2500 Da的寡肽比多肽具有更强的抗氧化能力，分子质量为200～500 Da的二肽或三肽与单个氨基酸相比也表现出较强的抗氧化能力[26]。因此，推测鹰嘴豆抗氧化肽表现出的抗氧化能力与其较低的分子质量分布有关。

表3 鹰嘴豆多肽分子质量分布Table 3 Molecular mass distribution of chickpea peptides

图2 鹰嘴豆抗氧化肽分子质量分布色谱图Fig.2 Chromatograms showing molecular mass distribution of chickpea antioxidant peptides

2.4 纯化肽的抗氧化能力

从图3可以看出，纯化肽的自由基清除能力及还原力均呈现出一定的剂量依赖性增加。DPPH自由基和ABTS阳离子自由基在体外研究中广泛用于评估植物样品的自由基清除特性[27]。从图3A、B可以看出，纯化肽的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基的清除能力较好，尤其是ABTS阳离子自由基清除能力接近对照组GSH，分别最高达到（57.09±3.13）%和（92.93±0.18）%。羟自由基作为最强的氧自由基之一，也是评估抗氧化的重要指标。从图3C可以看出，纯化肽的羟自由基清除能力几乎与对照组GSH（（78.55±0.85）%）的清除能力相当，最高为（76.71±0.33）%。

抗氧化剂是通过自身的还原作用，给出电子而清除自由基的。因此测定还原能力可以评估抗氧化剂提供电子或氢原子的潜力。抗氧化剂能将铁氰化钾的三价铁还原成二价铁，二价铁进一步和三氯化铁反应生成在700 nm波长处显示有最大吸收峰的普鲁士蓝，吸光度越高则表示样品的还原能力越强[28]。从图3D可以看出，GSH展现了最高的还原力，最高达到1.88±0.13。而纯化肽的还原力最高达到0.58±0.11，显著低于对照组GSH。但在质量浓度为1 mg/mL（0.10±0.01）时显著高于豌豆肽（0.012，1 mg/mL）[29]。以上结果表明纯化肽具有较好的清除自由基的能力和还原力。

图3 纯化肽不同质量浓度对DPPH自由基（A）、ABTS阳离子自由基（B）、羟自由基（C）的清除能力及还原能力（D）Fig.3 DPPH radical (A),ABTS cation raical (B),and hydroxyl radical scavenging capacity (C) and reducing power (D) of purified peptide at different concentrations

2.5 纯化肽的脂质氧化抑制能力

采用体外脂质过氧化模型评估纯化肽的抑制活性。将不同质量浓度的纯化肽与GSH比较144 h。结果表明（图4），与对照组（无样品）相比，纯化肽显著延缓脂质过氧化，5 mg/mL的纯化肽（脂质氧化抑制率61.74%）抑制脂质过氧化的能力最强，但其对脂质过氧化的抑制能力仍稍弱于对照GSH（脂质氧化抑制率73.50%）（P＜0.05）。虽然天然抗氧化剂不如合成抗氧化剂有效，由于合成抗氧化剂的使用具有严格的限制[30]，且蛋白质水解物的掺入可以为食品赋予其他理想的营养和功能特性。因此，发芽鹰嘴豆多肽有可能替代合成抗氧化剂。

图4 不同质量浓度纯化肽对脂质氧化的抑制能力Fig.4 Inhibitory activity of different concentrations of purified peptide on lipid oxidation

2.6 纯化肽对蛋白质氧化损伤的保护作用

AAPH是一种叠氮化合物，是公认的自由基诱导剂。在37 ℃，pH 7.0条件下，AAPH会分解产生过氧自由基[31]。因此，在37 ℃条件下，AAPH可使BSA发生氧化损伤，通过AAPH体系产生过氧自由基，诱导蛋白质的氧化损伤，考察不同质量浓度的纯化肽对蛋白质损伤的保护作用，结果见图5。添加AAPH之后，BSA条带减弱，而添加不同质量浓度的纯化肽之后，BSA条带逐渐增强，说明鹰嘴豆抗氧化肽对蛋白质氧化损伤具有保护作用，并且具有浓度依赖性。

图5 不同质量浓度纯化肽对蛋白质损伤的保护作用Fig.5 Protective effects of different concentrations of purified peptide on protein damage

2.7 纯化肽对DNA氧化损伤的保护作用

采用羟自由基诱导DNA氧化损伤，考察纯化肽对DNA氧化损伤的保护作用，结果见图6。未被羟自由基损伤的原质粒pBR322 DNA的超螺旋条带较强，而加入Fe2＋和H2O2反应后，DNA超螺旋条带显著减弱，表明羟自由基对pBR322 DNA有损伤作用。但加入纯化肽后，超螺旋结构的DNA逐渐增多，并且随着样品浓度逐渐增加，以超螺旋形式存在的DNA显著增多。这些结果表明，该多肽能显著抑制羟自由基诱导的DNA氧化损伤。这可能是因为该多肽可以阻止Fe2＋和H2O2反应，并通过提供氢原子和电子而直接清除羟自由基，进而保护质粒DNA不被损伤[32]。在王悦等[33]研究中也有类似的发现。

图6 不同质量浓度纯化肽对DNA损伤的保护效果Fig.6 Protective effects of different concentrations of purified peptide on DNA damage

2.8 抗氧化肽的鉴定与合成

采用LC-MS/MS法检测鹰嘴豆抗氧化肽纯化之后肽段的组成及其序列，本检测方法的扫描范围为350～5000 Da。质谱采集的raw文件，经过软件Byonic数据库检索，得到1633 条肽段，选取了得分较高的5 条肽段分别为GGLSFISPSEKQPRH、DHLDFSDETDTK、AGDTHLGGEDFDNR、SDALDKIRFE、KEGTLAPF，其分别来源于（A0A1S2XSB9_CICAR）（251-265）、（A0A1S2Y9D7_CICAR）（20-31）、（A0A3Q7XXP6_CICAR）（229-242）、（A0A1S2Y850_CICAR）（40-49）、（A0A1S2YBR2_CICAR）（390-397）。

使用BIOPEP数据库（http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep）进行了肽序列搜索，未找到AGDTHLGGEDFDNR、SDALDKIRFE肽序列。因此，这两条从鹰嘴豆中分离的肽序列被认为是新的。对这两条肽序列进行了合成（纯度＞95%），并对其DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由基清除活性、还原能力等进行了评价，它们的抗氧化活性各不相同，如表4所示。可以看出，两条肽序列都有较好的自由基清除能力，肽SDALDKIRFE的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力均高于肽AGDTHLGGEDFDNR，与肽AGDTHLGGEDFDNR的羟自由基清除能力和还原力不具有显著差异。两条肽的DPPH自由基和羟自由基清除能力均高于同样浓度下纯化多肽，其ABTS阳离子自由基清除能力和还原力略低于同浓度下纯化多肽。这可能是由于多肽分子质量和氨基酸组成不同导致。经氨基酸组成分析结果可知，肽AGDTHLGGEDFDNR、SDALDKIRFE的疏水性氨基酸含量分别占43%、40%，因而其具有较好清除DPPH自由基和羟自由基的能力。大量研究表明，肽的抗氧化活性与其氨基酸序列、组成、分子质量和疏水性密切相关[14]。抗氧化肽的分子质量是决定抗氧化活性的关键因素之一。表4中鉴定出分子质量相对较低（1194～1504 Da）的活性肽，由10～14 个氨基酸残基组成，这一发现与报道一致[34]，即大多数抗氧化活性的多肽含有2～20 个氨基酸，分子质量低于6000 Da，其抗氧化活性远比它们的亲本蛋白质分子（20～50 个氨基酸）具有更强的抗氧化活性。Guo Hang等[35]研究蜂王浆抗氧化肽的构效关系，发现在肽序列的C-末端含有Lys残基或Arg残基的肽序列Phe-Lys、Phe-Pro-Arg表现出较强的抗氧化活性，本实验从鹰嘴豆蛋白分离纯化的抗氧化肽序列AGDTHLGGEDFDNR（Asp-Asn-Arg）与上述肽段的相似结构，所以该条多肽的抗氧化活性可能与C-末端含有的Arg残基有重要关系。Agrawal等[36]首次从珍珠粟蛋白水解物分离并表征了一种具有较好抗氧化能力的肽SDRDLLGPNNQYLPK，认为该肽具有抗氧化能力与肽序列中含有疏水性氨基酸Gly，Leu和Pro的存在有关。Feng Yanxia等[37]从板栗蛋白水解物中鉴定出5 种抗氧化肽VYTE、TKGQ、MMLQK、TPAIS和VSAFLA，其中VYTE和VSAFLA显示出最高的ABTS阳离子自由基清除能力，认为肽VYTE的抗氧化能力与复合结构VY的存在有关，肽VSAFLA的抗氧化能力与疏水性氨基酸（例如，N末端的Val；C末端的Ala；以及部的Ser、Ala、Phe和Leu）的存在有关。

表4 LC-MS/MS鉴定肽的抗氧化活性和特征Table 4 Antioxidant activity and characteristics of peptides identified by LC-MS/MS

2.9 毒性和致敏性预测

自然界中，某些多肽具有毒性，如鹅膏毒肽类、蜂毒肽类、蛇毒肽类等，有些多肽毒性可致死[38]，有些多肽具有致敏性[39]。因此，有必要对鹰嘴豆蛋白源的抗氧化肽AGDTHLGGEDFDNR、SDALDKIRFE进行安全性评估，结果见表5。由检测结果可知，基于氨基酸序列预测，AGDTHLGGEDFDNR、SDALDKIRFE无致敏性、无毒性，安全性较高。因为所用预测结果是利用数据库预测得来，所以和最终结果会存在偏差。若要进一步研究所合成肽在人体是否具有毒性或者致敏性则需进行细胞或者体内实验。

表5 肽序列的安全性预测Table 5 Safety prediction of synthetic peptides

3 结论

以发芽鹰嘴豆为原料，对其水解后的抗氧化肽进行分离纯化，并通过各种方法评价其抗氧化活性。结果表明，发芽鹰嘴豆纯化肽具有较好的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、羟自由基清除能力和还原力。并且由于其高含量的疏水性氨基酸而显著抑制脂质过氧化，保护自由基诱导的蛋白质和DNA损伤。经预测，合成肽无毒性与致敏性。本研究可为从发芽鹰嘴豆中制备抗氧化肽提供理论依据，同时提高鹰嘴豆的利用价值。可进一步研究这些肽在食品工业和体内模型中的应用，以证实实验的假设。