新型小分子化合物cyy-287联合CDK抑制剂roscovitine抑制SBC-2细胞生长的机制

郑淑文，黄慧静，陈国，麻浩群，钱建畅，张倩雯

温州医科大学 药学院，浙江 温州 325035

小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）是肺癌中恶性程度较高的类型，约占所有肺癌病例的15%，具有极高的增殖率、强烈的早期转移倾向和不良预后，患者5年平均生存率不超过10%[1-2]。目前，以铂类和依托泊苷为基础的化疗仍是SCLC一线标准治疗方案，尽管大部分患者在化疗初期应答良好，但大多会在一年内出现耐药复发，临床亟需新的治疗药物和干预策略。cyy-287为本课题组新合成的嘧啶-2，4-二胺衍生物（见图1），为小分子多靶点激酶抑制剂，前期研究发现其在骨肉瘤中有良好的抗肿瘤活性[3]。另通过药代动力学实验发现cyy-287在肺组织中选择性较高，且在EGFR突变非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中具有良好的抗肿瘤活性，显著抑制其在体内外的生长、迁移并逆转上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）[4]。本研究探索了cyy-287与细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent protein kinase,CDK）抑制剂roscovitine联用对SCLC的抑制作用，以期为SCLC的临床治疗提供新的方案。

图1 cyy-287的化学结构式

1 材料和方法

1.1 材料 SBC-2细胞购自赛百慷（上海）生物技术股份有限公司。cyy-287由本实验室自行合成，纯度≥98%，并通过1H NMR、13C NMR、电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS）和高分辨率质谱（high resolution mass spectrometry,HRMS）等方法验证其结构。顺铂（dichlorodiammineplatinum,DDP）、ABT-199和roscovitine购自美国APExBIO公司，MTS试剂购自美国Promega公司，碘化丙啶染料购自美国Sigma公司，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。CL-PARP、P-AKT、AKT和GAPDH抗体从美国CST公司购买。

1.2 方法

1.2.1 试剂配制：精密称取适量的cyy-287、多西他赛、BCL-2抑制剂ABT-199和roscovitine样品，加入一定体积的二甲基亚砜（DMSO），制备浓度为20 mmol/L的储备液。精密称取适量的DDP样品，加入一定体积的ddH2O，制备浓度为3 mmol/L的储备液。涡旋混合均匀后分装，保存于-80 ℃冰箱备用，并于使用前稀释。

1.2.2 细胞培养：SBC-2 细胞使用RPMI 1640 完全培养基（加入10%的FBS，含100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素和1 mmol/L丙酮酸钠），置于37 ℃，5% CO2的饱和湿度培养箱中培养，根据细胞扩增速率确定传代倍数。

1.2.3 实验分组：SBC-2细胞分为DMSO（对照）组、roscovitine（20 μmol/L）组、cyy-287组（1.5 μmol/L）和cyy-287（1.5 μmol/L）+roscovitine（20 μmol/L）组。

1.2.4 细胞活力测定和药物联合指数（combination index,CI）：将细胞接种在96孔板（5%～10%密度）中，并用不同浓度的cyy-287和DDP（60、20、6.67、2.22、0.74、0.25、0.08、0.027 μmol/L）处理48 h后，弃掉上清液，每孔加入100 μL MTS工作液，将细胞培养板放入37 ℃培养箱中孵育1～2 h。待颜色达到合适深度，用酶标仪检测490 nm处吸光度（A）值。细胞相对活力（%）=（加药组细胞A均值-空白对照组A均值）/（阴性对照组A均值-空白对照组A均值）×100%。为了获得CI，操作同上，另增加多西他赛（docetaxel,DTX）、BCL-2抑制剂ABT-199和roscovitine单用组，以及分别和cyy-287 的合用组（比例为1∶1）。选取5个浓度（2.220、0.740、0.250、0.082、0.027 μmol/L）进行CI计算，并使用Compusyn软件分析CI，当CI＜1时表明协同作用，当CI＞1时表明拮抗作用。

1.2.5 克隆形成实验：将细胞以800个/孔的密度接种在12孔板中，然后用不同浓度的药物处理8 d。细胞集落用4%多聚甲醛固定20 min，用0.5%结晶紫溶液（购自美国Sigma公司）染色30 min。

1.2.6 流式细胞术检测细胞周期和凋亡：将细胞接种在6孔板（20%～25%密度）中，并用不同药物处理24 h。根据Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明书检测细胞凋亡比例。对于细胞周期，首先收集细胞并在4 ℃下用70%乙醇固定24 h。使用磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤两次后加入碘化丙啶（propidium iodide,PI,50 μg/mL）室温避光染色10 min。使用BD-FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）检测并分析细胞周期分布和细胞凋亡比例。

1.2.7 Western blot检测蛋白表达：将细胞接种在12孔板（20%～25%密度）中，并用不同药物处理24 h。使用NuPAGE LDS裂解缓冲液（购自美国Invitrogen公司）收集蛋白样品，并进行免疫印迹检测。

1.3 统计学处理方法 采用Microsoft Excel和GraphPad Prism 8进行数据处理和统计学分析。计数资料用±s表示；多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 cyy-287对SCLC细胞SBC-2生长的作用 以DDP为阳性对照，通过MTS实验发现cyy-287对SBC-2细胞的IC50为（1.77±0.10）μmol/L，与DDP的IC50值（1.47±0.26）μmol/L相近（见图2A）。细胞凋亡检测结果表明，与DMSO组比，梯度浓度的cyy-287虽然可以诱导肿瘤细胞发生凋亡，但比例均小于15%；而在同等浓度（3 μmol/L）下，单独使用cyy-287（14.88%）或DDP（10.3%）的凋亡细胞比例相近（见图2B）。这表明cyy-287对SBC-2细胞的生长抑制作用相对较差，与DDP对SCLC的抗肿瘤效果相当。

图2 cyy-287对SBC-2细胞的抑制作用

2.2 cyy-287与roscovitine的协同效应 通过分析CI，发现cyy-287与常用的抗肺癌化疗药物DTX和BCL-2抑制剂ABT-199等并不存在协同抗肿瘤作用，但cyy-287与CDK抑制剂roscovitine合用的CI＜1，提示两者间存在协同效应（见图3）。

图3 cyy-287与roscovitine协同效应CI值图

2.3 cyy-287与roscovitine联用对SBC-2细胞增殖的影响 通过克隆形成实验发现，与cyy-287组比，cyy-287+roscovitine组可显著抑制SBC-2细胞的克隆形成，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。表明cyy-287 与roscovitine联用确实可以有效抑制SBC-2的增殖。

图4 cyy-287与roscovitine联用对SBC-2细胞增殖的影响

2.4 cyy-287 与roscovitine联用对SBC-2 细胞周期的影响 通过流式细胞术分析了cyy-287 与roscovitine单用或联用对SBC-2细胞周期的影响，与DMSO组比，roscovitine组和cyy-287组轻度增加G2/M期细胞，而cyy-287+roscovitine组显著增加G2/M期细胞，S期细胞减少，见图5；提示cyy-287与roscovitine联用可诱导SBC-2细胞周期阻滞在G2/M期。

图5 cyy-287与roscovitine联用对SBC-2细胞周期分布的影响

2.5 cyy-287与roscovitine联用诱导SBC-2细胞凋亡情况 通过流式细胞术检测cyy-287与roscovitine单用或联用对SBC-2细胞凋亡的影响，与DMSO组比，roscovitine组和cyy-287 组SBC-2 细胞发生凋亡的较少，差异无统计学意义（P＞0.05）；而roscovitine+cyy-287组凋亡的SBC-2细胞明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见图6。提示cyy-287与roscovitine联用可显著诱导SBC-2细胞发生凋亡。

图6 cyy-287与roscovitine联用对SBC-2细胞凋亡的影响

2.6 cyy-287与roscovitine联用对SBC-2细胞AKT活化的影响 与cyy-287组比，cyy-287+roscovitine组SBC-2细胞凋亡相关蛋白CL-PARP的表达明显增加（P＜0.05）；与roscovitine组比，cyy-287+roscovitine组AKT的磷酸化水平明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见图7。这提示cyy-287主要通过抑制AKT的活化，从而与roscovitine发挥协同抗肿瘤作用，抑制SBC-2细胞的存活，并诱导其发生凋亡。

图7 cyy-287与roscovitine联用对SBC-2细胞CL-PARP蛋白表达和AKT磷酸化的影响

3 讨论

约70%的SCLC患者在确诊时就已出现胸腔以外的转移，也称广泛期SCLC，该类患者中位生存时间仅为8～13个月，5年生存率不到2%[5-6]。然而，SCLC的生物分型尚不成熟，尽管经过了30多年的努力和探索，SCLC临床治疗的研究进展依旧十分有限。SCLC的靶向治疗仅有我国原研的小分子多靶点抗血管药物安罗替尼获批用于进展或复发SCLC患者的三线治疗[7-8]。虽然免疫抑制剂如阿特珠单抗等与传统化疗药物相关的联合治疗方案已成为广泛期SCLC的一线治疗标准之一，但与其他实体瘤比，阻断PD-1对SCLC患者生存率的总体改善并不明显，仅有少数患者在免疫治疗中获益[9-11]。因此，临床亟需寻找SCLC治疗的新策略，开发出新的可用于临床替代的治疗药物。

cyy-287作为一种新型的可口服的抗肿瘤小分子抑制剂[3]，虽然在骨肉瘤和NSCLC中表现出良好的抗肿瘤活性，但本研究发现其对SBC-2细胞的体外抑制效果仅与DDP相当，对SCLC细胞的生长增殖抑制作用有限，提示单独使用cyy-287可能无法有效抑制SCLC生长。SCLC作为一种高侵袭性的神经内分泌肿瘤，其临床治疗往往采用联合用药的手段[12]。因此，尝试通过联合用药筛选，探索新的可用于抑制SCLC的干预手段，结果发现CDK抑制剂roscovitine与cyy-287具有协同的抗肿瘤效应，而活性研究结果也显示，两药联合可有效抑制SBC-2细胞的增殖，使其细胞周期阻滞在G2/M期，并诱导细胞出现明显的凋亡。这些研究结果表明两者联合对SBC-2细胞具有良好的体外抑制效果。

细胞周期失调是肿瘤的重要特征之一，而CDK对细胞周期的调控起着至关重要的作用。目前，已有超过40多种CDK抑制剂用于抗肿瘤药物研发，其中roscovitine作为多靶点的CDK抑制剂，广泛用于基础研究和疾病研究[13]。roscovitine主要通过直接竞争ATP结合位点抑制CDK，它能够有效抑制CDK1、CDK2、CDK5和CDK7，但对CDK4和CDK6的抑制效果较差[14]。作为一种可口服的小分子CDK抑制剂，roscovitine在包括骨肉瘤[15]、多发性骨髓瘤[16]和前列腺癌[17]等多种恶性肿瘤中发挥较好的抗肿瘤活性。同时，通过单一疗法或联合疗法，roscovitine也在NSCLC、鼻咽癌和转移性乳腺癌中开展II期临床试验研究[18]。一系列的研究表明，该药可以做为肿瘤治疗的潜在药物。但本研究结果表明roscovitine对SBC-2细胞的抑制效果十分有限，并不能有效抑制肿瘤细胞的增殖，或诱导细胞凋亡；说明单独使用roscovitine对SCLC抗肿瘤作用并不明显。

本研究结果表明，通过将cyy287与roscovitine相结合不仅能够显著抑制SBC-2的克隆形成，还可以明显增加凋亡细胞的比例，提示两者具有良好的协同抗肿瘤作用。两者均为可口服的小分子化合物，后续如果有类似化合物进入临床研究，通过将两类药物联合，或许会发挥出更好的抗肿瘤活性，有可能成为SCLC治疗的潜在方案。