兰科植物与微生物共生关系的研究进展

罗影子,王大昌,覃玉强,黄明进,*

(1.贵州大学 农学院/石斛研究院/贵州省药用植物繁育与种植重点(工程)实验室,贵州 贵阳 550025;2.贵州创禾源农业科技有限公司,贵州 贵阳 550025)

兰科植物(Orchidaceae)约有700属20 000多种,地生、附生或较少为腐生草本,极罕为攀援藤[1],分布极其广泛。兰科植物不仅有很强的观赏价值,还有较高的药用价值,如石斛(Dendrobiumnobile)、天麻(Gastrodiaelata)、杜鹃兰(Cremastraappendiculata)等均是我国名贵中药材[2],但因过度采挖,栖息地生态环境遭到破坏,野生资源越来越稀少,人工繁育已成为保护资源、有效开发利用的重要途径。采用常规大田作物生产方式繁育兰科植物通常难以获得成功,而依靠共生菌的促生作用,很容易培育出良好的植株,但兰科植物种类多,与微生物共生关系极其复杂,前期研究基础薄弱,对共生机理认识不够,寻找相关促生菌困难,这给一些珍稀难繁兰花的种苗繁育、规模化生产、迁地保护带来挑战。近年来,在对植物与微生物共生关系的深入研究中发现很多新的机制,如Jiang等[3]发现了脂肪酸是植物传递给菌根真菌的主要碳源形式;Li等[4]通过比较分析兰科植物真菌异养三类演化生活型(初始型、部分型和完全型)的物种基因组,揭示了真菌异养兰花形态建成和营养获取的分子机制。同时,全基因组、宏基因组、互作/空间转录组、单细胞等测序技术的广泛应用,为兰科植物与微生物的互作共生研究提供了强大技术工具和平台。本文对共生微生物多样性、促生作用、技术手段等方面的研究进展进行综述,以期为兰科植物野生资源保育和开发利用、人工栽培以及微生物菌剂等研究提供参考。

1 兰科植物共生微生物多样性

根际土壤微生物与植物内生菌均具有多样性,对其多样性物种鉴定、理化性质分析、功能作用研究及促生菌剂开发应用等是兰科植物与共生微生物多样性关注的重点研究内容。

1.1 根际微生物多样性

兰科植物根际土壤微生物的研究主要集中在根际细菌、根际真菌和根际促生菌方面,细菌多为变形菌门(Protecbacteria)、酸酐菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)这几个门类,真菌多为担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)和蜜环菌科(Nectriaceae)、红菇科(Russulaceae)、镰刀菌属(Fusarium)等类型[5-9];赵凯鹏[10]发现少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)和芽孢杆菌(Paenibacillusmucilaginosus)两种细菌对铁皮石斛生长有促进作用;罗影子等[11]从高产和低产天麻根际土壤微生物中鉴定出6个差异物种,认为根际土壤微生物与天麻的产量有关。随着兰科植物根际土壤微生物的研究越来越多,兰科植物根际微生物被发现的种类和数量也在增加,这无疑丰富了兰科植物根际微生物的多样性。

1.2 内生细菌多样性

目前为止,从兰科植物中已分离出内生细菌近60个属,且诸多研究发现这部分细菌可促进兰科植物进行光合作用、发芽分化、抵御病虫害等,对其生理生长发育有非常重要的影响。Wilkinson等[12]从13种西澳大利亚地生兰中分离得到多种内生细菌,其中假单胞菌属(Pseudomonas)细菌为优势菌,是兰科植物分离得最多的菌属。研究表明,假单胞菌能够杀死细菌竞争者并侵入生物膜,在与根相关的生活方式中发挥重要作用[13];其次是芽孢杆菌属(Bacillaceae)、库特氏菌属(Kurthia)和节杆菌属(Arthrobacter)[14-15]。对鸟巢兰[16]、石斛[17]、白及[18]、金线莲[19]、五唇兰[20]等60多种兰科植物的研究也发现,假单胞菌和芽孢杆菌为多数植株内部的优势菌种。兰科植物的内生细菌易受到兰科植物的种类、根龄、生长季节以及菌根真菌的影响而产生差异,如地生兰和附生兰由于着生方式不同,气生根根表上的细菌群落丰度比基生根根表上的高很多[21-22]。翅柱兰属的植株与其他兰科植物不同,其植株内生细菌为革兰氏阴性菌,推测这是造成形态与一般兰科植物不同的原因。随着宏基因组、扩增子等测序技术的广泛应用,兰科植物内生细菌潜在的新菌属也不断被发现,进一步丰富了兰科植物内生细菌资源,技术的进步让内生细菌在植物中的重要性越来越受到重视,其研究显示出巨大的潜力和广阔的前景。

1.3 内生真菌多样性

在1992年,Currah等[23]就已将兰科植物内生真菌专门的基本检索表列出,其中记载了15个属、29个种及2个腐生类群。有研究发现,与兰科植物形成共生结合体的真菌多为担子菌门(Basidiomycotina)的角担菌科(Ceratobasidiaceae)、蜡壳耳科(Sebacinaceae)和胶膜菌科(Tulasnellaceae)真菌[24-25]。兰科植物与内生真菌具有专一性,刚开始许多研究者对此有不同的认识,直到Masuhara等[26]提出“生态专一性(Ecological specificity)”和“潜在专一性(Potential specificity)”理论,这一观点才逐渐被接受,如蕊兰属Cephalantheraaustinae仅与革菌科(Thelephoraceae)的真菌共生、珊瑚兰属的Corallorhizamaculata和C.mertensiana仅与红菇科(Russulaceae)的真菌共生[27]、珊瑚兰属(Corallorhiza)植物C.striata仅与革菌科(Thelephoraceae)的真菌共生[28]、构兰属植物共生菌根真菌都聚在胶膜菌科(Tulasnellaceae)[29]、附生兰花Sarcochilusweinthalii仅与角担菌属(Ceratobasidium)共生形成菌根[30]、天麻(Gastrodiaelata)与小菇属(Mycena)和蜜环菌属(Armillaria)真菌共生才能萌发和生长等[31-32],均体现了兰科植物内生真菌的高度专一性;兜兰属、构兰属和石斛共生真菌都属于胶膜菌科(Tulasnellaceae),表现出兰科植物与内生真菌的偏好性[33-34]。除此之外,兰科植物与内生真菌的专一性关系也极容易受到植物种类、营养类型、生态环境、地理分布等条件影响[35]。内生真菌专一性在一定程度上受到共生真菌分布的限制,因此,提高兰科植物对环境的适应性是解决兰科植物保育的有效途径。

2 兰科植物与微生物促生作用

2.1 促进生长发育

尽管很多兰科植物对共生真菌具有高度专一性,但从种子萌发到开花结果整个生长过程中不仅只与一种真菌共生,萌发菌促种子萌发后,其植株后期的生长需与其他的真菌伴随[36],如天麻小菇属萌发菌可以促进天麻种子萌发,但其营养生长还需要蜜环菌。除此之外,细菌也可以促进兰科植物生长发育,其主要通过分泌IAA、促进光合作用、生物固氮、促进矿质营养的循环、产生铁载体及合成其他活性物质等方式促进兰科植物种子萌发、根系生成、增强长势、促进幼苗生长[37-38]。另一方面,根系代谢物会通过影响根际微生物来驱动土壤对植物生长和防御的反馈[39]。

2.2 促进营养物质吸收

共生真菌能促进兰科植物的营养吸收,兰科植物根系不发达,难以吸收周围的水分及营养元素,需要依赖共生真菌为其提供营养。真菌主要以有机氮的形式向植物传递氮源,且可以从植物中以铵盐形式获取氮源[40]。丝核菌形成的共生体系也会促进兰科植物吸收N、P元素等无机养分,且对于雀巢兰和天麻等不能进行光合作用的完全异养型兰科植物来说,整个生命过程都需要真菌来提供养分[41];有研究认为,菌根真菌和土壤微生物群落之间的协同作用也能增加植物对氮的获取[42]。除此之外,细菌也可以通过生物固氮、溶磷菌、解钾菌及螯合铁载体等为兰科植物提供C、P、Fe等营养物质[43-44]。

2.3 抵抗外界胁迫

微生物可促进兰科植物提高抗性、抵御病原菌侵染及病虫害入侵,小菇属真菌可增加金线莲的黄酮类和金线莲苷类成分,菌根真菌MF23可增加金钗石斛生物碱含量,说明真菌可促进兰科植物次生代谢物的含量增加,从而抵抗病原菌[45-47]。Herrera等[48]发现兰科植物在重金属富集环境下,植株内部的真菌增多;McCormick等[49]发现部分兰科植物只有在干旱条件下才能生长开花。而兰科植物共生细菌则通过竞争生态位和营养、生成抗生素、合成水解酶以及诱导植物产生系统抗性等途径来促进植物防治病虫害,提高抗性。程萍等[50]发现从石斛叶片分离的结芽胞杆菌R14和地衣芽胞杆菌R21对镰刀菌叶斑病有防治作用。

2.4 促进分泌次生代谢物

真菌可以刺激兰科植物分泌一些次生代谢物,在石斛转录组中MF23可诱导光合基因(petF)、淀粉和蔗糖代谢基因(SUS,bcsA,glgA)、果糖和麦芽糖合成基因(PMM,GFMM)上调表达,同时抑制糖酵解(PGK,PFK)和三羧酸循环(PDHB,CS,SDHA)相关基因表达,从而调控植物体内多糖含量。而甲羟戊酸途径中PMK及MVD基因,以及细胞色素P450、转氨酶以及甲基转移酶基因表达量升高,可促进石解碱的生物合成[51-52]。对金线莲转录组的研究发现,关键酶PAL和4CL以及类黄酮合成途径中关键酶CHS等参与黄酮类化合物生成的基因均显著上调表达[53],这些试验结果证明真菌可以通过调节植物基因表达水平从而调节植物代谢产物的生成。

2.5 促进分泌生长激素

激素信号调控分子机制是真菌与兰科植物共生过程不可缺少的一部分,兰科植物会分泌帮助真菌成功定殖或干扰植物产生防御的激素,同时植株内部的真菌也会分泌促进植物生长的激素,如赤霉素、生长素、脱落酸、玉米素、玉米素核糖苷等[54];在对铁皮石斛与真菌共生萌发过程中,赤霉素GA受体GID1和阻遏蛋白DELLA在植物体内形成GA-GID1-DE信号调控机制,在种子萌发过程中发挥重要作用,独角金内酯SL有关的重要差异表达基因明显上调表达[55-57]。Liu等[58]在金线莲中也发现真菌可以显著增强GA-GID1-DELLA调控模式中GA20ox、GA2ox以及DELLA基因的表达,从而催化赤霉素的合成。说明真菌分子可能参与兰科植物多种胁迫和激素应答响应。

3 兰科植物与微生物共生研究方法

目前,大多采用传统分离培养法以及Biolog法、磷脂脂肪酸法、分子生物学方法等来研究土壤微生物多样性[59]。rDNA片段高通量测序目前被国内外学者广泛用于兰科植物不可培养类微生物的研究,454焦磷酸测序及Illumina MiSeq、Illumina HiSeq等[60-64]测序平台近年逐渐出现在微生物研究中。此外,全基因组、宏基因组、转录组、单细胞测序等技术的应用也很广泛,在天麻的基因组研究中,发现其缺少光合作用相关的基因,相反线粒体相关基因表达上调,且结合ITS和PCR扩增鉴定发现,相对于天麻此类非光合兰科植物,其光合作用、生物钟、开花时间调节、免疫、养分吸收及根叶发育等相关基因都出现丢失情况[65-67]。在石斛的基因组研究中,发现其基因蛋白参与药用代谢成分的合成,且与植株的生长发育有关[68-70]。

目前分子生物学法被国内外研究者广泛使用,对于兰科植物内生细菌多样性的研究,主要采用16S rDNA序列法与核糖体DNA扩增片段限制性分析(ARDRA)相结合[71]。对于兰科植物内生真菌多样性和专一性的研究,大多采用Taylor等[72]的ITS序列特异性引物,优化扩增方法,减少兰科植物ITS序列的干扰[73-74]。除此之外,也可结合一些特殊的分离技术和方法对兰科植物内生菌特别是那些难分离出来的种类进行研究,如随机克隆、变性梯度凝胶电泳(DGGE),T-RFLP(Terminal RestrictionFragment Length Polymorphism),ARDRA(Analysis and Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis)等[75-79]。

尽管非培养法能绕过微生物培养环节,获得比传统方法更多的信息,对样品的要求也不局限于新鲜组织,但不能得到微生物菌株实体,也不能完成接种工作和形态学鉴定等研究,因此对于兰科植物共生微生物的研究还是以传统分离培养法为主,辅以分子技术手段,得到的结果才可靠。

4 兰科植物共生微生物研究展望

4.1 提升对研究手段的应用,加强对共生微生物的鉴定

兰科植物微生物用传统分离培养法分离菌株时培养基所营造的小环境不能满足其生存的所有条件,只能满足小部分要求,想要对其进行形态学特征鉴定也非常困难,不能准确反映微生物的真实分布情况及群落结构。而现代技术非培养法虽能弥补传统分离培养法的不足,但对于菌株实体、接种、生物学特性等方面还是无法实现。因此对于兰科植物微生物研究需将传统分离培养法与现代分子技术结合,优化分离方法,取长补短,这对共生微生物群落多样性、群落构成及影响群落构成因素等的深入研究有很大的帮助。

4.2 强化兰科植物与微生物的共生机制的研究

共生真菌的高度专一性会导致兰科植物对环境适应性低,甚至达到濒危地步,且涉及共生识别机制,但关于兰科植物与共生微生物的互作机制研究较少,在营养机制方面,生物为植株提供营养的种类、识别方式、流动模式、转移通路、转运模式等都未见详细报道;在抗逆机制方面,微生物在抗逆过程中扮演的角色、调控机制、单独作用尚未可知;在分子机制方面,大多局限于基因表达推测其对植株的功能作用,国内外尚未建立具体的共生遗传转化体系,关于信号分子及信号转导的途径尚未可知,因此亟需探明微生物共生初始阶段的识别机制、关键基因及分泌的信号分子,找到维持兰科植物与微生物共生的互作机制、营养成分的转运调控机制等。

4.3 研制高效的微生物菌剂,加大共生微生物在兰科植物生产上的应用

有些兰科植物整个生活史都离不开微生物的供给,包括种子萌发、幼苗生长及花芽的形成与分化等,且微生物可促进兰科植物抵御病原菌侵入、提高代谢水平、促进药用活性成分的产生、促进吸收营养成分等,但在兰科植物的不同生长阶段,所需共生的微生物不同,且微生物的种类、浓度、添加时间、单一菌种及混合菌种等都会影响其与兰科植物的共生关系,在适宜的时期添加适宜浓度的微生物菌剂是需要攻克的难题。但我国的微生物菌剂研究比国外缓慢,目前还处于起步阶段,因此,筛选优良的共生微生物、合适的菌液浓度、微生物种类配比等,对兰科植物种质资源的保护和恢复都有极大贡献,是兰科植物共生微生物研究的重点及热点。