基于慢性乙型肝炎证候系统生物学基础的宫内感染研究进展及思路

陶承静，刘寿荣，荀运浩，胡健女，张素英，白秀丽，赵春，左中宝

浙江中医药大学附属杭州市西溪医院，浙江 杭州310023

乙型肝炎病毒（HBV）感染目前依然是一个严重的全球公共卫生问题。2016 年世界卫生大会提出到2030 年消除病毒性肝炎的战略目标[1]，2021 年世界卫生组织（WHO）发布报告概述了目前消除HBV 取得的进展：2019 年全球约有2.96 亿慢性乙型肝炎（CHB）感染者，其中6 500 万为育龄妇女[2]，形势依然严峻。

1 HBV 的宫内感染

HBV 传播有经血液和性接触等水平传播，及经胎盘、脐带、羊水、精子等母婴、父婴垂直传播。母婴传播是HBV 感染的主要传播途径[3]，包括经胎盘宫内传播、分娩时产道传播和产后哺乳传播3 种途径。可能高危因素包括HBV DNA 高载量、HBV 结构和突变、孕妇的乙型肝炎病毒e 抗原（HBeAg）阳性、母体宫内环境、胎盘屏障和胎儿遗传易感性。目前国内外指南均要求乙肝表面抗原（HBsAg）阳性且HBV DNA≥105copies/mL 的孕妇在妊娠中晚期口服抗病毒药物，新生儿出生后接受主动（乙型肝炎疫苗）-被动免疫（乙型肝炎免疫球蛋白），两者联合有效降低了HBV 的垂直传播率[4]，但仍然存在1.2%～5%的失败率[5]，有研究认为这可能与无法明确HBV 如何突破胎盘屏障感染胎儿的机制相关。目前存在几种学说：渗漏学说[6]、细胞转移学说[7]、外周血单个核细胞（PBMC）学说[8]、HBV 病毒颗粒的胞吐作用学说[9]。

2 系统生物学与证候系统生物学

系统生物学是一门研究基因、蛋白质和代谢物等的构成及其在遗传、环境等因素变化过程中相互关系的学科[10]。从整体的高度，采用系统论的方法，从基因、蛋白质、细胞、组织、个体的分层角度研究其功能以及各组学间的相互关系，整合建立模拟生物系统的模型，预测其在各种环境因素干扰下的动态行为，分为基因、蛋白质等各种组学。

证候系统生物学是一种新兴交叉学科[11]。从中医学整体观、治未病、辨证施治等基础理论出发，综合系统生物学的理论与技术，从基因、蛋白质、代谢物等不同层面对证候进行定量化、标准化、客观化[12]。CHB 证候系统生物学研究平台[13]，是利用系统生物学理论与技术探索不同证型的特异性指标，将中医病证规范化、诊断指标定量化和疗效评定客观化。目前中医临床将CHB 患者的主要中医证型候分为5 型：湿热内结证、肝郁脾虚证、肝肾阴虚证、瘀血阻络证、脾肾阳虚证[14]。已经发现不同中医证候分类存在不同的HBV 基因型，与外周血淋巴细胞亚群（PBMC）之间也存在一定的相关性[15]，其临床疗效及预后也不同。

系统生物学、CHB 与中医证候的结合、发展与应用，为HBV 宫内感染机制的研究提供了手段和思路。笔者基于CHB 证候系统生物学方法，从基因、蛋白、代谢等角度，从不同组学层面探讨不同证候分类的宫内传播机制：不同证候间母体个体基因和蛋白表达谱的区别，与孕期HBV 感染者的主要中医证型候的相关性，母婴传播阻断失败与HBV 基因突变、基因多态性的关联，预测中医辨证与关键蛋白质和代谢网络的相关性，以期从CHB 中医证候联合生物系统学寻找解决当前困局的思路。

3 系统生物学与HBV 宫内感染

3.1 基因组学与HBV 宫内感染基因组学（Genomics）是从基因表征、定量、结构、相互关系中研究基因内在活动的规律，及其对机体影响包括测量基因表达、鉴定基因功能、研究生物信息，分析遗传密码[16]。

基因表达差异性及序列多态性，在临床中表现为不同的个体差异、症状和体征，在中医证候中表现为不同的证候表型[12]。HBV 感染后的自然病程及临床转归也受到病毒的基因型、病毒基因变异、病毒与宿主基因整合等影响[17]。

2005 年HBV 全基因组首次克隆成功，这个全新技术为HBV 基因多样性与不同致病性和不同传播途径等关系的研究打开了窗口[18]。大量证据表明HBV基因型与HBV 的流行、传播模式和临床结果相关，可以作为确定地理分布与传播模式相关性的流行病学标志物，HBV 的基因型B 型和C 型在亚洲人群最容易出现，与宫内感染也具有较高的相关性[19]，感染后也更倾向发展为慢性肝炎和肝硬化。但国内韩国荣团队认为虽然HBV 的基因型与母婴传播有相关性，但是不能作为是否会发生免疫失败导致宫内感染的一项预测指标[20]。近年也有研究认为基因B 型孕妇使用抗病毒药物时，HBV DNA 下降更明显，母婴阻断效果更好[21]。

HBV 具有高度优化的遗传组织，同时导致其灵活性也高，在逆转录步骤过程中由于缺乏基因突变自发错误校对，容易出现各种各样的基因型、亚型、突变、重组[19]。这样的变异也使得HBV 容易摆脱机体免疫监管而出现较高免疫逃逸、耐药性、复制率[22]，从而导致宫内感染的易感性。另一项研究结果表明HBV 基因变异的不同位点和量与中医证候具有相关性，基因B 型主要是湿热中阻证与肝郁脾虚证患者，基因C 型主要表现为脾肾阳虚证、肝肾阴虚证及瘀血阻络证患者，而肝郁脾虚证与HBV 基因型及基因变异的位点有一定的相关性，更易发生Per C 区变异。另一项临床检测认为，有报道称，HBV宫内感染的发生和辅助性T 细胞1（Th1）/辅助T 细胞2（Th2）类细胞有关细胞因子之间免疫失衡有关[23]，特别是中医证型为脾肾阳虚型的患者，容易出现IL-17/IL-10 失衡[24]，临床应用流式细胞仪检测调节性T 细胞（Treg）/Th17 的表达，以及其相关细胞因子白细胞介素-10（IL-10）、IL-17 的水平，发现宫内感染的孕妇及新生儿这些表达均增强，且肝郁脾虚型最高，结合不同中医分型孕妇的Treg/Th17 细胞因子能够制定预防措施来避免HBV 宫内感染的发生[24]。2019 年国内IL-18 调控Th1/Th2 网络平衡，监测HBsAg 阳性孕妇体内IL-18 水平，可以对是否发生宫内感染进行预判，还可以提前干预来提高母体的细胞免疫功能，有利于控制宫内传播[25]。这说明鉴定HBV基因型的和监测HBV 基因组某些区域的变异，作为对HBV 感染患者评估是否发生宫内感染的一项预判指标，并实施个体化管理，具有一定的临床意义。2018 年最新的改良巢氏PCR 法完成了对低浓度HBsAg 的CHB 全基因分析和低拷贝HBV DNA 全基因扩增[26]，发现了HBV 的BCP 区、PreC 区和C 基因区突变与肝脏损伤及肝病进程相关，不同中医证候类型有着不同的HBV DNA 核苷酸突变率，其中湿热内蕴证候型的最高[27]。研究基因多态性与中医证候分型的相关性，有助于了解不同证候表型的妊娠期CHB 患者发生宫内感染的几率，以及对抗病毒药物治疗反应的个体差异。

3.2 蛋白质组学与HBV 宫内感染蛋白质组学（Proteomics）主要研究蛋白质组成成分及其动态变化特有规律，通过基因表达调控的机制来阐述疾病发病机理，通过比较和分析正常个体与病理个体之间的差异蛋白，寻找到疾病发生、发展过程中的特异性蛋白质分子，这为疾病的早期诊断可量化的客观指标和理论依据。

由于在疾病的不同阶段、不同情况下，蛋白质的分型和表达也不相同，随着空间和时间的不断动态变化，CHB 的中医证候蛋白质组学，就是寻找不同中医证候间的差异蛋白质，将中医证候诊断进行客观化、标准化，指导临床应用。

母婴垂直传播是CHB 患者患病的主要病因，胎盘滋养层是母婴传播的天然屏障，然而HBV 如何通过滋养层引起胎儿感染的机制不清楚。陈京龙团队采用液相PCR 法检测出HBV 感染孕妇胎盘组织中存在HBV 闭合环状DNA（cccDNA）信号，证实了HBV可感染胎盘各层细胞并进行复制[28]。有研究认为HBV 病毒表面的S 蛋白可以与胎盘Hofbauer 细胞（绒毛间质内一种巨噬细胞）表面的FcɣRⅢ（CDl6）特异性结合，介导吞噬及摄入作用，引起胎儿宫内感染，阻断FcɣRⅢ受体表达可能会可降低患者宫内感染风险[29]。白晓霞及其团队[30]研究认为S100 蛋白的高表达可能与HBV 的经胎盘宫内感染有关。一部分HBV 劫持了自噬蛋白分泌途径，经由S100A10/AnxA2 复合物和多泡体（MVB）介导的胞吐作用通过滋养层发生易位，如果敲除滋养层细胞中AnxA2 或S100A10 会导致滋养层HBV 病毒数量的减少，这为了解并阻断HBV 宫内感染和母婴传播提供了另一个潜在的靶点[31]。

3.3 转录组学与HBV 宫内感染转录组学，在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科，是根据一些基因在一定条件下表达出的信息来推断出未知基因的功能和作用机制的一种学科，也称表达谱。由于外源性和内源性因素影响，转录组学具有特定的时空性[32]。中医证候转录组学主要以转录组学方法检测中医证候患者样本，采取不同方法进行干预，并对比分析干预前后结果。

国内学者白桂琴[33]应用抑制性消减杂交（SSH）技术从HBV 感染胎盘组织中筛选出了参与细胞生长调节、基本代谢、氧化损伤、畸变等有关差异表达基因。白晓霞[34]也发现HBV 可以上调体内体外的胎盘滋养层内HBD-3 和A3G 的表达，这种上调的缺乏可能与HBV 的宫内传递有关。2021 年白桂琴团队进一步研究发现，HBx 通过下调Smc5/6 促进滋养层细胞中HBV 复制，激活EGFR 启动子，通过下调PI3K/p-AKT 信号通路抑制滋养层细胞凋亡，从而增加HBV 宫内感染的风险[35]。2022 年北京佑安医院高虹采用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和免疫印迹法分别检测胎盘绒毛膜中自噬小体相关基因和蛋白的表达水平，发现HBV 感染母体的胎盘中自噬小体水平增加，并随HBV 载量的增加而显著上调。高水平的病毒血症可能是自噬小体活性和MTCT 的原因[36]。在高病毒载量或HBeAg 阳性的孕妇中，自噬水平显著上调在HBV MTCT 中起着重要的作用，在HBV 宫内感染中起着重要的作用。

早在2013年，国内有学者研究发现CHB 湿热蕴结型患者和肝郁脾虚型患者具有不同基因分子表达模式。肝郁脾虚证患者、脾胃湿热证两证候间存在显著差异表达基因，miR-129-1-3p、miR-129-2-3p与中医证候肝胆湿热证具有一定的相关性，miR-1273g-3p 与脾胃湿热证具有一定的相关性[37]。

因此，采用转录组学方法对不同中医证候的宫内感染患者进行研究，为揭示HBV 的宫内感染提供新的技术平台。

3.4 代谢组学与HBV 宫内感染代谢组学，是定性定量分析生物体细胞内在某一时刻的低分子量代谢物，并找寻其在生理病理变化中的规律，是系统生物学的重要组成部分。基本方法是采用高通量检测技术结合信息模式识别和专家系统整合等方法，反映了细胞所处的环境。主要有液相色谱-质谱联用（LC-MS）、气相色谱-质谱联用（GO-MS）技术和代谢轮廓分析（Metabolomic profiling）等。

随着代谢组学的快速发展，其在HBV 感染中的应用也日趋广泛，有研究显示在正常人和HBV 感染人群中存在柠檬酸、乌头酸等代谢物的差异，为乙型肝炎的发病机制以及乙肝治愈提供了新的视角[38]：对于不同中医证候的CHB 患者可筛选出特征性的小分子代谢物，来评估病情及指导治疗。研究认为CHB 中医证型与生化学指标具有一定的相关性，在一定程度上可反应疾病进展程度及阐释疾病临床表现的中医机理[39]。

HBV 感染导致患者在妊娠期机体病理生理过程变化，引起代谢产物发生相应的改变，目前鲜少有研究，如果通过对某些代谢产物进行分析，并与正常人的代谢产物比较，寻找出宫内感染的生物标记物，可以提供一种较好的鉴别方法来判断宫内感染倾向、并进行母婴传播阻断。

4 存在的问题及小结

疾病产生是一个多变化的持续过程，从单一层面的数据变化来解释分析疾病的整个发生发展过程具有一定的局限性，而系统生物学和中医证候学都是从整体、系统、联系方面出发，采用多学科交叉来阐释基因-信息通路-证候间的具体联系。为了更好地研究HBV 宫内感染的生物学机制，可以以转录组学为基点，利用系统生物学、中医证候学关联多个纬度的组学数据，对不同中医证候分类的慢性HBV 感染孕妇，在差异基因变化规律、miRNA 调控的作用机制、蛋白质群、代谢标志物的比较和关联这几个方面开展深入研究，发现相关特征性基因表达和代谢物，选取与自己研究相关的方面进行整合分析，观察其在各个层面的不同变化，探究作用机制，从而找到最有效的研究方向。