基于离子色谱法测定乳及乳制品中亚硝酸盐含量

张丽芳，张淼怡，刘宇奇，郑百芹，周璇，谷守国

1. 唐山市食品药品综合检验检测中心（唐山 063000）；2. 河北省农产品质量安全检测工程技术创新中心（唐山 063000）；3. 唐山市功能性农产品产业技术研究院（唐山 063000）

乳及乳制品中含有丰富的蛋白质、脂肪、乳糖、维生素和矿物质等营养元素，在日常饮食中占据越来越重要的地位，其质量安全问题也越来越受到关注。亚硝酸盐广泛存在于土壤、地表水、植物和生物系统中。亚硝酸盐与食品中固有的胺类化合物是产生亚硝胺的前体物质，亚硝胺在动物试验中被证实为致癌物。大量摄入亚硝酸盐可诱导高铁血红蛋白血症，导致组织缺氧[1-2]。新生婴儿对亚硝酸盐非常敏感，且乳制品摄入量大。奶牛的养殖环境、饲养用水及饲料中亚硝酸盐含量过高，有可能导致牛乳中的亚硝酸盐含量超标[3]。因此对乳品中亚硝酸盐进行安全监控十分必要[4]。

鉴于亚硝酸盐对人体的危害性，各国制定食品中亚硝酸盐的添加量和残留量相关限量。世界卫生组织食品添加物联合专家委员会规定：亚硝酸盐每日摄取安全容许量为0～0.06 mg/kg[5]。GB 2762—2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》[6]规定：乳及乳制品中生乳的亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）不得大于0.4 mg/kg；乳粉及特殊膳食用食品（婴幼儿配方食品、婴幼儿谷类辅助食品、孕妇及乳母营养补充食品等）亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）不得大于2 mg/kg。

乳制品中亚硝酸盐的常见检测方法有分光光度法、液相色谱法、气相色谱法、流动注射法、离子色谱法和液相色谱-质谱联用法[7-10]。这些方法存在各自的优缺点，如：分光光度法操作复杂，引入镉污染物，易对环境造成污染；气相色谱法灵敏度不高，不能满足乳制品的限量要求；离子色谱法作为无机阴离子分析技术，具有快速、灵敏、选择性好等优点，但GB 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》[11]中离子色谱法前处理过程需要过柱，操作复杂，成本高。试验采用离子色谱法测定乳及乳制品中亚硝酸盐含量，通过优化前处理条件和筛选色谱分析参数，旨在建立一种准确、快速、低成本的检测方法，为乳及乳制品中亚硝酸盐的测定研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

亚硝酸根标准物质（1 000 μg/mL，北京北方伟业计量技术研究院）；乙腈（色谱纯，DiKMA）。

1.2 仪器与设备

883 Basic IC plus离子色谱仪（瑞士万通）；PL2002分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；LYNX4000高速低温冷冻离心机（Thermo Scientific）；Gd-16高速均质机（新锐科技）。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

1.3.1.1 液态奶和乳饮料

称取20 g样品，精确至0.01 g，至50 mL准确量值的离心管中，加入乙腈定容至50 mL，充分涡旋振荡，静置10 min。样品按10 000 r/min离心10 min。取液体过0.45 μm水相滤膜后上机。

1.3.1.2 奶粉

称取5 g样品，精确至0.01 g，至50 mL准确量值的离心管中，用20 mL水复溶，加入乙腈定容至50 mL，充分涡旋振荡，静置10 min。随后，样品按10 000 r/min离心10 min。取液体过0.45 μm水相滤膜后上机。

1.3.1.3 干酪

称取2.5 g样品，精确至0.01 g，至50 mL准确量值的离心管中，加入20 mL水，加入数粒陶瓷珠，高速匀浆2 min，超声30 min，取出放置至室温，加乙腈定容至50 mL，充分涡旋振荡，静置10 min。随后，样品按10 000 r/min离心10 min。取液体过0.45 μm水相滤膜后上机。

1.3.2 色谱条件

色谱柱Metrosep A Suup7-250/4.0；柱温35 ℃；进样量50 μL；淋洗液流速0.7 mL/min；淋洗液3.6 mmol/L Na2CO3。

1.3.3 标准溶液配制

1.3.3.1 标准储备液

精确量取0.1 mL 1 000 μg/mL的亚硝酸盐标准溶液至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，制备成10 μg/mL标准储备液。

1.3.3.2 标准中间液

精确量取1.0 mL 10 μg/mL标准储备液至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，制备成1 μg/mL的标准中间液。

1.3.3.3 标准曲线

精密吸取0.1，0.2，0.4，0.8，1.0和2.0 mL标准中间液分别至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，制备成0.01，0.02，0.04，0.08，0.10和0.20 μg/mL的标准曲线。

1.3.3.4 基质匹配标准曲线

精密吸取0.1，0.2，0.4，0.8，1.0和2.0 mL标准中间液分别至10 mL容量瓶中，用基质空白提取液定容至刻度，制备成0.01，0.02，0.04，0.08，0.10和0.20 μg/mL的基质标准曲线。

1.3.4 计算公式

试样中亚硝酸盐（以NO2-计）含量按式（1）计算。

式中：X为试样中亚硝酸盐含量，mg/kg；C为试样中实测亚硝酸盐质量浓度，mg/L；V为试样溶液体积，mL；f为稀释倍数；m为试验质量，g。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法的选择

2.1.1 样品沉淀剂的选择

乳及乳制品中测定亚硝酸盐去除蛋白和脂肪的沉淀剂种类较多，如乙酸锌+亚铁氰化钾、钨酸钠+硫酸、冰乙酸、冰乙酸+乙腈、三氯乙酸+乙腈、乙醇等。乙酸锌+亚铁氰化钾对于乳制品有很好的蛋白沉淀效果，是液相色谱法和分光光度法常用的沉淀剂，但在离子色谱中这些沉淀试剂会引入大量金属离子，污染色谱柱，降低离子色谱柱效[12-13]。乙酸沉淀法基线相对较平直，同时亚硝酸根不受乙酸根的影响，但在低体积分数时，亚硝酸盐可能受pH影响加速转化，使回收率偏低。

乙醇、乙腈是较为理想的蛋白沉淀剂，试验发现乙醇的沉淀效果比乙腈的沉淀效果差，选择乙腈作为蛋白沉淀剂。有机相与水相的比例会影响蛋白沉淀效果和回收率，比较乙腈与水相的体积比分别为7∶3，6∶4，5∶5，4∶6和3∶7时的沉淀效果和对亚硝酸根回收率的影响，结果见表1。在20 g液态奶或乳制品制备成20 mL液态试样时，加入约30 mL乙腈（V乙腈∶V水=6∶4），蛋白沉淀效果最理想，未出现分层现象，回收率高，确定为蛋白沉淀的最佳条件。试验以乙腈为沉淀剂，沉淀效果与回收率（回收率98.4%）均优于颜琪等[14]以1∶1的乙腈-3%乙酸为蛋白沉淀剂（回收率97.3%）。

表1 蛋白沉淀剂的选择

干酪试样在水中的溶解度低，样品经高速均质后超声提取，亚硝酸盐回收率优于试样加入水后直接超声提取。对超声提取时间进行优化，亚硝酸盐回收率随着超声时间的延长而提高，到30 min后，回收率趋于稳定，因此确定超声时间为30 min。

2.1.2 分离参数的优化

试样经蛋白沉淀后，离心进行分离，以亚硝酸盐的回收率为评价指标，筛选出离心转速与时间，设计因素与水平见表2，所得结果见表3。随着离心转速的提高和时间的延长，蛋白分离效果变好，亚硝酸盐的回收率提高后趋于平稳。结合操作时间综合考虑，选择10 000 r/min、离心时间10 min作为分离参数。

表2 离心转速和时间对亚硝酸盐回收率的影响试验设计

表3 离心转速和时间对亚硝酸盐回收率的影响试验结果

2.1.3 净化参数优化

由于乳制品中的氯离子含量较高，奶粉中氯离子含量一般在800～1 000 mg/L[15]。按照GB 5009.33—2016，氯离子浓度大于100 mg/L时，待测液需要依次通过针头滤器、C18柱、Ag柱和Na柱，去除或降低待测液中氯离子浓度，以降低对亚硝酸盐的影响，但试验结果显示，亚硝酸根离子的回收率并未受到氯离子的影响，所得结果与冯伟科等[16]研究结果一致。试验方法在离心去除蛋白后，上清液直接过滤膜上机，不再用Ag柱、Na柱处理，大幅降低检测成本。

2.2 色谱条件的优化

试验考察Metrosep A Suup4-250/4.0和Metrosep A Suup7-250/4.0色谱柱对亚硝酸盐的分离效果。Suup4色谱柱采用的淋洗液为1.8 mmol/L Na2CO3和1.7 mmol/L NaHCO3，流速1.0 mL/min，亚硝酸根的出峰时间为5.20 min，但奶的基质有干扰峰，通过调节淋洗液和流速并未有所改善。Suup7色谱柱采用3.6 mmol/L Na2CO3为淋洗液，流速0.7 mL/min，亚硝酸根与杂质峰能得到很好分离，出峰时间14.4 min。提高淋洗液的离子浓度或流速，离子的保留时间会缩短，但不利于干扰离子与亚硝酸根的分离，流速的增加也显著增大系统的压力。综合考虑，确定采用Metrosep A Suup7-250/4.0色谱柱，3.6 mmol/L Na2CO3为淋洗液，流速0.7 mL/min，作为试验的色谱条件。标准溶液色谱图和奶粉基质色谱图见图1。

图1 标准溶液（A）和奶粉基（B）质色谱图

2.3 基质效应

基质效应（Matrix effects，ME）是指样品中除分析物以外的组分，在分析过程中对目标物有显著干扰。基质效应影响大时会降低方法的灵敏度，影响方法的准确性，给测定带来误差[17]，因此，方法开发和确证过程中需要对基质效应做出评价。按照样品的前处理方法分别制备液态奶、奶粉、干酪的基质空白提取液。分别用基质空白提取液和水配制系列浓度的标准溶液，按照试验方法进行测定。一般认为，基质匹配校正曲线斜率与标准曲线斜率的比值在0.85～1.15之间不存在基质效应[18-19]。试验液态奶、奶粉、干酪的基质效应分别为0.95，0.74和0.68，结果表明液态奶的基质效应较弱，而奶粉和干酪具有较强的抑制作用。分析原因是奶粉和干酪中除了蛋白质、脂肪和碳水化合物外，有多种不同种类的物质，如维生素类、无机盐类、植物油类、添加剂等。因此，液态奶检测采用标准曲线进行校正，奶粉和干酪采用基质匹配的标准曲线进行校正。

2.4 方法学确定

2.4.1 标准曲线、检出限和定量限

选择0.01，0.02，0.04，0.08，0.10和0.20 μg/mL标准工作液，按1.3.2的仪器条件进行测定。以峰面积Y（μs·min）为纵坐标，质量浓度X（μg/mL）为横坐标，做标准曲线，以3倍信噪比确定检出限，以10倍信噪比为定量限。所得线性方程、线性相关系数、检出限和定量限见表4。

表4 标准曲线线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.4.2 方法的回收率与精密度

为验证方法的可靠性，采用基质加标法对回收率和精密度进行考察，在液态奶、奶粉和干酪中添加标准溶液，制备成0.5，1.0和2.0 mg/kg这3个质量分数水平，每个添加水平6个平行。在低、中、高3个浓度条件下，回收率在85.4%～101.3%之间，精密度为1.5%～7.1%。试验方法具有良好的回收率和精密度，能够满足检测需求，结果见表5。

表5 方法的加标回收率及相对标准偏差（n=6）

3 结论

试验方法适用于液态乳、乳粉及干酪乳制品中亚硝酸含量的测定。通过对前处理方法优化、流动相的选择、色谱柱的比较、结果稳定等方面的讨论，确定乳及乳制品中亚硝酸盐分离提取及色谱分析的最佳参数：蛋白沉淀剂采用乙腈，与试样的体积比6∶4，按离心转速10 000 r/min、离心时间10 min分离蛋白，上清液经0.45 μm滤膜过滤，以3.6 mmol/L Na2CO3为淋洗液，流速为0.7 mL/min，进行色谱分析。方法的回收率为85.4%～101.3%，精密度为1.5%～7.1%，满足检测需求。奶粉和干酪样品以基质匹配的标准曲线进行校正，降低基质效应对检测结果的影响。该方法前处理方法简单、成本低、检出限低，优于国标方法，能够满足乳及乳制品中亚硝酸盐的检测要求，可为食品安全监督提供有效的技术支撑。