miR-210-5p对脓毒症小鼠心肌损伤的调控作用及其分子机制

2023-03-03 07:11刘治国李炜董文婷张晓东

山东医药 2023年5期

刘治国，李炜，董文婷，张晓东

西安国际医学中心医院心脏内科，西安 710100

脓毒症是一种严重危及生命的疾病，定义为系统性感染并伴有急性器官功能障碍，多器官功能障碍综合征（MODS）被认为是脓毒症的终末状态［1］。尽管MODS根据受影响的器官不同而呈现不同的临床症状，但当伴有心血管并发症时，患者死亡风险可达70%～90%［2］。脓毒症诱发的心肌病是一种可逆性心肌功能障碍，其病理机制是由炎症细胞因子、线粒体功能障碍、局部缺血、内皮素、心肌抑制剂物质上调和抗凝系统激活而造成的心肌损伤［3］。微小RNA（miRNA）是一组小的非编码RNA，通过促进信使RNA（mRNA）降解或阻断mRNA翻译来负调控基因表达。许多miRNA被认为是某些疾病诊断或治疗的生物标志物和可能靶点。研究显示，miR-210的表达在急性心肌梗死、动脉粥样硬化、主动脉狭窄和心力衰竭等心血管疾病中发生改变［4］，且miR-210过表达对这些疾病的靶器官具有保护作用［5］。另有研究发现，miR-210-5p过表达可缓解高氯化钠饮食大鼠心脏的纤维化进展［6］。然而，miR-210-5p在脓毒症心肌损伤中的作用及机制尚未见报道。2022年4月—9月，本研究通过盲肠结扎穿孔术建立脓毒症小鼠模型，观察miR-210-5p在脓毒症心肌损伤中的作用并探讨其机制，旨在为脓毒症所致心肌损伤的治疗提供新的靶点及方向。

1 材料与方法

1.1 主要材料清洁级雄性C57BL/6小鼠40只，8周龄，体质量22～25 g，购自空军军医大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（军）2007-007号。肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌钙蛋白I（cTnI）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；超氧化物阴离子荧光探针（DHE）购自美国Invitrogen公司；TUNEL检测试剂盒购自瑞士Roche公司；过氧化物酶（MPO）、剪切半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase-3）、沉默调节蛋白 1（SIRT1）、叉头框蛋白 O1（FOXO1）、乙酰化 FOXO1（Ac-FOXO1）、核因子κB亚基 p65（NF-κB p65）、乙酰化 NF-κB p65（Ac-NF-κB p65）及GAPDH抗体均购自美国Abcam公司，羊抗兔、羊抗鼠二抗购自北京中杉金桥公司，miR-210-5p、肿瘤坏死因子 α（TNF-α）、白细胞介素 1β（IL-1β）、IL-6、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）及内参U6、GAPDH引物均由上海生工生物工程有限公司构建。

1.2 动物建模及分组处理将40只C57BL/6小鼠随机分为对照组、脓毒症组、脓毒症+miR-210-5p激动剂组、脓毒症+miR-210-5p拮抗剂组，每组10只。除对照组外均采用盲肠结扎穿孔术建立小鼠脓毒症模型［7］。操作步骤：小鼠用2%的异氟烷麻醉后腹部脱毛，在腹部皮肤组织中线垂直切口2～3 cm，打开腹膜进入腹腔。将位于腹部左侧的盲肠小心拉出，并将粪便内容物挤向盲袋。距盲肠末端1 cm用丝线结扎回盲瓣远端盲肠组织，使用18号针，在盲肠上进行两次穿透性穿刺。为了确认穿刺针穿刺成功，在还纳腹腔之前，将少量粪便从盲肠通过穿刺孔暴露出来。使用6.0丝线缝合腹膜及皮肤，然后腹腔注射预热生理盐水（0.05 mL/g）进行复苏。对照组小鼠采用不结扎、不穿刺的剖腹手术进行对照。脓毒症+miR-210-5p激动剂组、脓毒症+miR-210-5p拮抗剂组小鼠在建模前1 d及建模术后即刻分别经尾静脉注射10 nmol/L的miR-210-5p激动剂agomir及miR-210-5p拮抗剂antagomir，对照组和脓毒症组在相同时间经尾静脉注射等体积生理盐水。

1.3 miR-210-5p对脓毒症小鼠心功能的调控作用观察采用超声心动图。小鼠经2%异氟烷麻醉后，剔除胸前毛发，置于恒温操作台。使用Vevo770超声心动图系统经胸超声心动图评价小鼠左心室功能的变化，在长轴和短轴视图下分别获得二维和M模式图像。对每只小鼠采集3个独立心动周期的图像，测量左心室射血分数（LVEF）和左心室缩短分数（LVFS），以此评价左心室收缩功能。

1.4 miR-210-5p对脓毒症小鼠心肌损伤的调控作用观察

1.4.1 心肌组织病理改变采用HE染色。各组心功能检查后处死，取出心脏，采集部分心脏样本，在4%的多聚甲醛中固定过夜，脱水，石蜡包埋，切成5 μm的切片。脱蜡后，心肌组织切片在分级乙醇溶液中复水，用苏木精和伊红染色，光镜下观察心肌组织病理改变。

1.4.2 血清心肌损伤标志物CK-MB、cTnI 采用比色法。各组小鼠处死后，颈动脉留取1 mL血样，静置离心后获得上层血清，采用比色法严格按照试剂盒说明书测定小鼠血清CK-MB、cTnI水平。

1.5 miR-210-5p对脓毒症小鼠心肌组织细胞凋亡的调控作用观察

1.5.1 细胞凋亡率采用TUNEL染色。将“1.4.1”制备好的心脏石蜡脱蜡并在分级乙醇溶液中复水，使用TUNEL凋亡检测试剂盒对细胞进行染色分析。通过末端脱氧核苷基转移酶dUTP切口末端标记反应检测到凋亡细胞显示为绿色，通过DAPI染液染色所有细胞的细胞核显示为蓝色，使用激光共聚焦显微镜观察并获取图像。凋亡率以凋亡细胞数（绿色）/计数细胞总数（蓝色）×100%表示。

1.5.2 凋亡蛋白cleaved Caspase-3 采用Western blotting法。取各组心脏组织，用裂解缓冲液提取蛋白质，用BCA法测定总蛋白浓度。用SDS-PAGE分离蛋白质并转移到PVDF膜上。分别加入cleaved Caspase-3及GAPDH（1∶1 000）一抗孵育膜过夜，用山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）二抗孵育膜。使用Bio-Rad成像系统检测条带，以GAPDH为内参对蛋白进行半定量分析，以目的条带与对照条带灰度比值作为目的蛋白相对表达量。

1.6 miR-210-5p对脓毒症小鼠心肌组织炎症反应的调控作用观察

1.6.1 中性粒细胞浸润采用免疫组化染色将“1.4.1”制备好的心脏石蜡脱蜡并在梯度级乙醇溶液中复水，用3% H2O2在室温下作用10 min，抑制内源性过氧化物酶活性。切片用5%山羊血清阻断30 min，使用抗MPO一抗（1∶200）在4 ℃下孵育过夜。洗涤后继续将切片与山羊抗兔IgG二抗在37 ℃孵育30 min。干燥后，用中性胶固定切片，在显微镜下观察中心粒细胞浸润情况，以MPO免疫组化染色相对表达强度反映心肌组织中性粒细胞浸润程度。

1.6.2 炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1 采用实时荧光定量PCR法。各组心功能检查后处死，取出心脏，采集部分心肌组织样本，TRIzol试剂提取心肌组织样本中总RNA，根据PrimeScript™RT Master Mix的说明书，使用随机引物从RNA中反转录提取cDNA，所有cDNA在使用前保存在-80 ℃。引物序列：TNF-α正向引物5'-ACTCCAGGCGGTGCCTATG-3'，反向引物 5'-GTGAGGGTCTGGGCCATAGAA-3'；IL-1β正向引物5'-TGATGTGCTGCTGCGAGATT-3'，反向引物 5'-TGCCACCTTTTGA-CAGTGATG-3'；IL-6 正向引物 5'-TGATGGATGCTACCAAACTGGA-3'，反向引物 5'-TGTGACTCCAGCTTATCTCTTGG-3'；MCP-1 正向引物 5'-TAAAAACCTGGATCGGAACCAAA-3'，反向引物 5'-GCATTAGCTTCAGATTTACGGGT-3'；GAPDH 正向引物5'-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'，反向引物5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACTC-3'。反应条件：94 ℃、5 min，94 ℃、10 s，60 ℃、20 s，72 ℃、30 s，重复扩增40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算心肌组织TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1相对表达量。

1.7 miR-210-5p对脓毒症小鼠心肌组织氧化应激水平的调控作用观察

1.7.1 抗氧化物SOD、GSH、GSH-Px 采用比色法。取各组小鼠左室心肌组织10 mg，充分研磨后均质于测定缓冲液中，严格按照试剂盒说明书测定心肌组织中抗氧化物SOD、GSH和GSH-Px表达。

1.7.2 过氧化物MDA 采用比色法。方法同“1.7.1”，严格按照试剂盒说明书测定心肌组织过氧化物MDA表达。

1.7.3 活性氧（ROS）生成采用DHE染色。取小鼠左心室心脏标本经液氮速冻后切成10 μm厚的冰冻切片，滴加DHE染液反应30 min，使用激光共聚焦显微镜观察并获取图像，用Image J软件分析结果，以DHE荧光强度表示心肌组织ROS生成情况。

1.8 miR-210-5p对脓毒症小鼠心肌组织SIRT1通路相关蛋白的调控作用观察

1.8.1 SIRT1蛋白采用Western blotting法。取各组小鼠心脏组织，转膜后加入SIRT1、GAPDH一抗（1∶1 000），其余操作方法同“1.5.2”。以GAPDH为内参，以目的条带与对照条带灰度比值作为目的蛋白相对表达量。

1.8.2 FOXO1、NF-κB p65乙酰化程度采用Western blotting法。取各组小鼠心脏组织，转膜后加入FOXO1、Ac-FOXO1、NF-κB p65、Ac-NF-κB p65及 GAPDH 一抗（1∶1 000），其余操作方法同“1.5.2”。以GAPDH为内参，以目的条带与对照条带灰度比值作为目的蛋白相对表达量，以Ac-FOXO1/FOXO1、Ac-NF-κB p65/NF-κB p65 反映FOXO1、NF-κB p65乙酰化程度。

1.9 统计学方法采用GraphPad Prism统计软件。计量资料通过Sample K-S进行正态检验，符合正态分布的以±s表示，组间比较行t检验，多组间比较行单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。