细胞外调节激酶抑制剂PD98059对大鼠心肺复苏后脑缺血再灌注损伤的改善作用及其机制

黄京菊，李诺 ，韦永先，王文艳，覃涛，杨叶桂

1 广西医科大学第二附属医院重症医学科，南宁 530005；2 广西医科大学第一临床医学院；3 桂林医学院附属医院重症医学科

心肺复苏（CPR）后脑损伤是重症领域的热点研究方向。大脑在心跳骤停（CA）时失去血氧供给，会引起缺血性损伤；而CPR成功后恢复血氧供给，大脑仍有很大可能遭受缺血再灌注损伤，诱发神经细胞凋亡程序，导致脑损伤的发生及发展。细胞外信号调节激酶（ERK）是一种重要信号传递蛋白，其能将细胞水平的信号从细胞外受体传递至细胞核内，调节ERK磷酸化水平能够改变疾病的预后。有研究表明，ERK抑制剂PD98059在CPR动物模型中可降低磷酸化ERK（p-ERK）水平，减少脑组织天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）凋亡蛋白的激活，发挥神经保护作用［1］。茶多酚是提取自绿茶的具有药物作用的活性成分，能够降低细胞ERK磷酸化水平，与PD98059相似［2］。有学者发现茶多酚有抗细胞凋亡作用，其机制与降低Caspase-12和Caspase-3有关［3］，而Caspase-12是内质网应激相关凋亡信号途径的关键蛋白。据此，我们推测内质网应激相关凋亡信号通路可能参与了PD98059在CPR中神经保护的机制。2021年1月—2022年6月，本研究观察了PD98059对大鼠CPR后脑缺血再灌注损伤的改善作用，并分析其机制是否与内质网应激相关凋亡信号通路ERK/Calpain-2/Caspase-12有关。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠36只，体质量190～230 g，由广西医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（桂）2014-0002，本实验所有操作通过广西医科大学动物管理和应用委员会批准，符合动物伦理学标准。PD98059购自德国Sigma公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，兔抗大鼠β-actin抗体购自美国Abcam公司兔抗人钙蛋白酶2（Calpain-2）抗体购自上海生物科技有限公司，Caspase-12抗体、cleaved Caspase-3抗体购自美国CST公司，抗兔二抗、HRP标记购自美国CST公司。

1.2 动物建模及分组 CA/CPR建模：采用2%戊巴比妥钠（3 mL/kg）经腹腔注射麻醉大鼠，留置经口气管导管连接小型动物呼吸机，分离股动、静脉，股动脉置管用于监测动脉压，股静脉置管用于静脉给药，记录标准Ⅱ肢体导联心电图。按CHEN等［4］经食道电刺激诱导CA的方法，将起搏电极插入食道约7 cm深度，使用12 V交流电快速起搏诱导CA 60 s。将24只诱导CA大鼠按随机数字表法分为对照组及PD98059组各12只，在诱导CA 6 min后启动CPR，同时将PD98059组及对照组大鼠经静脉分别注射0.3 mg/kg的PD98059及同体积生理盐水。将余下12只健康大鼠作为假手术组，仅进行手术操作而不行电刺激诱导CA。

1.3 CPR效果评价 记录大鼠CPR后自主循环恢复（ROSC）时间、ROSC后24 h大鼠神经功能评分（NDS）。ROSC定义为出现室上性节律（包括窦性、房性或交界性心律）伴有平均动脉压≥50 mmHg并持续 5 min以上。根据简单行为反应、唤醒水平、颅神经反射、肌肉紧张、运动功能、癫痫发作进行NDS评估，总分0～80分，分数越低代表神经功能损伤越严重，脑死亡为0分［5］。

1.4 脑组织内质网应激相关凋亡蛋白检测 采用Western blotting法。ROSC后24 h经腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，快速取大鼠脑组织，分离脑皮质组织，提取脑皮质组织蛋白，并进行蛋白定量。按照4∶1的比例混合蛋白样品与缓冲液，沸水浴5 min使蛋白变性，放置室温冷却。制胶后，将变性的蛋白加入上样孔中，设定电泳电压为80 V，待电泳条带进入分离胶后将电压改为120 V；电泳完毕，切下相应的分子量胶片；在转膜、封闭后，分别加入兔抗Caspase-12、cleaved Caspase-3、Calpain-2、β-actin 单克隆一抗，恒温4 ℃的摇床孵育过夜，用TBST洗涤3次后，加入羊抗兔二抗、HRP标记，孵育 1 h，再次洗涤3次；加入化学发光剂，应用电化学发光法检测目标蛋白，再应用化学发光检测系统扫描获取图像。以β-actin作为内参，运用Gel-Pro Analyzer 分析，测定Caspase-12、cleaved Caspase-3、Calpain-2、条带的灰度值，以目的蛋白条带与β-actin条带灰度值的比值表示Caspase-12、cleaved Caspase-3 、Calpain-2、蛋白相对表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计量资料通过Sample K-S进行正态检验，符合正态分布的数据以±s表示，组间比较行SNK检验，多组数据比较行单因素方差分析，方差不齐数据采用非参数检验；计数资料以例或百分比表示，组间比较行χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PD98059组、对照组大鼠CPR效果比较PD98059组、对照组大鼠ROSC时间分别为（86.10 ±15.84）s、（89.00 ± 13.20）s，ROSC后 24 h NDS分别为（75.60 ± 1.27）、（71.91 ± 1.36）分；PD98059 组ROSC后24 h NDS高于对照组（P＜0.05），两组ROSC时间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 各组大鼠脑组织内质网应激相关凋亡蛋白比较 大鼠脑组织 Caspase-12、cleaved Caspase-3、Calpain-2蛋白表达假手术组＜PD98059组＜对照组（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠脑组织Caspase-12、cleaved Caspase-3、Calpain-2蛋白比较（±s）

表1 各组大鼠脑组织Caspase-12、cleaved Caspase-3、Calpain-2蛋白比较（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与对照组比较，#P＜0.05。

组别假手术组对照组PD98059组n 12 12 12 Caspase-12 0.37 ± 0.01 0.61 ± 0.01*0.44 ± 0.02*#cleaved Caspase-3 0.13 ± 0.02 0.27 ± 0.01*0.21 ± 0.01*#Calpain-2 0.29 ± 0.01 0.39 ± 0.01*0.34 ± 0.02*#

3 讨论

机体生理功能的实现依赖蛋白质，而内质网是蛋白质合成、折叠和修饰的重要细胞器。当细胞受到外来负面刺激时，内质网中未完成折叠或折叠错误的蛋白质比例增加，诱发内质网应激。在初期，内质网应激会启动包括自噬等多种机制，清除非正常形态的蛋白质，以保持内质网稳态［6］。当内质网应激程度较大，持续时间较长时，会诱导凋亡程序启动致细胞死亡［7］。Caspase-12被认为是内质网应激介导细胞凋亡的关键蛋白，其能够活化Caspase-3，后者裂解DNA引起细胞凋亡［8］。本研究结果显示，CPR后大鼠脑组织Caspase-12和cleaved Caspase-3水平升高，提示明内质网诱发的凋亡参与脑损伤机制。而PD98059组大鼠脑组织Caspase-12和cleaved Caspase-3水平降低，提示PD98059降低脑组织细胞凋亡的作用可能与减轻内质网应激有关。

ERK是细胞信号传导的重要功能蛋白质，而且已被证实参与了细胞凋亡的调控［9］。YANG等［10］发现，外伤引起的脑损伤模型中，ERK磷酸化表达水平上调，并且参与了细胞凋亡过程。而XIA等［11］发现，通过使用高压氧疗法下调磷酸化ERK蛋白表达可以减轻创伤性脑损伤水平。本研究结果与上述研究结果相似，我们在短暂CA后ROSC的大鼠脑组织中发现内质网应激相关凋亡蛋白表达增加，而使用PD98059降低EKR磷酸化水平后，内质网应激相关凋亡蛋白相应降低，提示PD98059通过抑制p-ERK表达降低了凋亡水平，从而发挥其神经保护作用。但是，有其他脑损伤动物模型和体外细胞研究发现，抑制ERK信号通路可能会引起脑损伤加重［12］。YANG等［13］研究显示，局灶缺血脑组织ERK磷酸化水平降低，当脑损伤发生以后使用药物提高p-ERK表达可减轻局灶缺血脑组织的损伤。我们认为在不同损伤模型中脑损伤发生的病理生理机制存在差异，因此，EKR在不同的疾病背景中发挥的作用不同，而此种现象为后期针对不同种类脑损伤使用不同药物提供了切实的基础证据。

ERK作为信号传导的关键蛋白，本身并不具备激活凋亡程序末位蛋白Caspase-3的能力。前期研究报道了PD98059能够减轻脑组织Caspase-3的激活水平，但文章尚未阐述凋亡蛋白激活机制［1］。为了完善前期研究结果，提供切实可靠的基础实验依据，对于特定疾病背景下与p-ERK关联的下游调控靶点的探索具有研究价值。体外实验研究发现，乳腺癌细胞中G蛋白偶联的雌激素受体需通过提高ERK磷酸化水平激活Calpain，从而提升自身黏附能力，而使用ERK抑制剂U0126能够降低该肿瘤细胞黏附能力［14］。该结果提示Calpain是ERK信号通路的下游调控靶点。

Calpain是细胞内依赖钙离子激活的蛋白酶，其活性与钙离子浓度正相关。当内质网应激水平过高时，细胞内钙离子升高从而激活Calpain，后者能够激活位于内质网表面的Caspase-12，启动内质网介导的细胞凋亡程序。Calpain拥有多个亚基，其中关于Calpain-1及Calpain-2的研究较多。何金玲等［15］研究显示，Calpain-2参与了机械性心肌细胞损伤的凋亡程序而不是Calpain-1。Calpain-2是一种钙离子依赖的半胱氨酸蛋白酶，Calpain-2活性增加可通过多种途径介导细胞凋亡。通过药物抑制EKR信号通路能够降低Calpain表达水平，减轻心肌细胞凋亡。另有研究表明，衣霉素通过Calpain-2/Ca2+依赖性内质网应激途径诱导肝星状细胞凋亡［16］。XIE等［17］认为，Ca2+依赖 Calpain-2 通过激活内质网中Caspase-12，促进了大鼠肝细胞内质网应激相关的异常凋亡。与既往研究相似，本研究在大鼠CRP后脑缺血再灌注损伤模型中使用PD98059抑制EKR磷酸化水平，发现 Calpain-2、Caspase-12、cleaved Caspase-3表达水平均下调，提示内质网介导的细胞凋亡减轻，验证了我们之前的推测，即PD98059通过抑制ERK/Calpain-2/Caspase-12信号通路降低内质网应激介导的细胞凋亡，从而减轻CPR后大鼠脑缺血再灌注损伤，发挥脑保护作用。

综上所述，细胞外调节激酶抑制剂PD98059能够减轻大鼠心肺复苏后脑缺血再灌注损伤，其机制可能通过抑制ERK/Calpain-2/Caspase-12信号通路，降低内质网应激介导的细胞凋亡实现。