过/降表达miR-92a的食管鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭能力及PTEN/PI3K/Akt通路蛋白表达变化

周家田，尚观胜，张聪，蒋德熊，袁冬冬，汤登尧，周江

成都市第七人民医院胸外科，成都 610123

食管鳞状细胞癌（ESCC）是食管癌的主要亚型，占所有食管癌病例的90%以上［1］。由于早期ESCC缺乏特异性症状，多数ESCC患者确诊时已处于中晚期，因此造成ESCC患者的预后较差，5年生存率低于20%［2］。miRNAs是一种非编码RNA，其与靶基因mRNA的3'-非翻译区（3'-UTR）非特异性结合，抑制其翻译或调节降解，以参与肿瘤的增殖、分化、迁移和凋亡［3］。目前已在多种肿瘤中发现miRNA的异常表达调控肿瘤进展，相关报道显示，miR-92a可在结直肠癌［4］，肺癌［5］及 ESCC［6］等肿瘤中通过抑制多种不同的靶基因调节肿瘤的增殖、迁移及侵袭。YANSHEN等［7］研究表明，miR-92a可通过靶向抑制磷酸酯酶与张力蛋白同源物（PTEN）从而促进前列腺癌的增殖，提示miR-92a可能通过PTEN/磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/Akt通路发挥其生物学功能。而关于miR-92a对ESCC细胞生物学特性的影响及其相关机制的报道较少。2022年1月—6月，本研究通过靶向调控miR-92a表达，观察了过/降表达miR-92a的ESCC细胞Eca-109增殖、迁移、侵袭能力及其与PTEN/PI3K/Akt通路的关系，以期为ESCC的临床靶向治疗提供必要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人ESCC细胞系Eca-109购自联组生物科技有限公司。RPMI-1640培养基、10%胎牛血清均购自美国Thermo，miR-92a过表达（miR-92a mimic）、miR-92a降表达（miR-92a inhibitor）以及对应的阴性对照质粒（mimic-NC、inhibitor-NC）均购自中国Ribobio，LipofectamineTM2000试剂盒购自美国Thermo，Hifair®Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Super-Mix for qPCR试剂盒购自中国翊圣生物，CCK-8检测试剂盒购自中国东仁化学，Matrigel购自美国BD Biosciences，光学显微镜购自日本Olympus。PTEN、磷酸化PTEN（p-PTEN）、Akt、p-Akt鼠抗人一抗购自中国三鹰生物，、PI3K一抗购自英国Abcam、p-PI3K一抗购自德国CST，GADPH一抗购自中国普健生物。

1.2 细胞培养及分组处理 将人食管鳞状细胞癌细胞系Eca-109置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。将Eca-109随机分为miR-92a过表达组、miR-92a降表达组、过表达阴性对照组、降表达阴性对照组，通过LipofectamineTM2000分别转染 miR-92a mimics、miR-92a inhibitor、mimic-NC、inhibitor-NC，转染 24 h。采用qRT-PCR法检测各组miR-92a相对表达量，使用TRIzol法提取总 RNA，使用 Hifair®Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR试剂盒合成和扩增 cDNA，使用 Hieff®qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒检测miR-92a表达水平，按照试剂盒说明书操作。利用miRBase软件设计miR-92a引物序列，miR-20a-5p引物序列：上游引物5'-GCCGAGTATTGCACTTGTCC-3'、下游引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'，内参U6上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'、下 游 引 物 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。采用2-ΔΔCt法计算 miR-92a-5p相对表达量。结果显示，miR-92a过表达组、过表达阴性对照组、miR-92a降表达组、降表达阴性对照组miR-92a相对表达量分别为（1.511 ± 0.270）、（1.186 ± 0.118）、（0.263 ±0.008）、（1.015 ± 0.086），miR-92a过表达组＞过表达阴性对照组、降表达阴性对照组＞miR-92a降表达组（P均＜0.05）；提示转染成功。

1.3 细胞增殖能力观察 采用CCK-8法。将各组细胞接种到96孔板中，在培养24 h、48 h、72 h、96 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃下孵育2 h。按照说明书要求通过酶标仪检测450 nm处的吸光度（A）值，以此评估细胞增殖能力。

1.4 细胞迁移能力观察 采用划痕愈合实验。将处于对数生长期的ESCC细胞接种到预先标记好的6孔板中。待细胞铺满板底后，用10 μL移液管尖端，在具有胎牛血清的融合细胞单层上产生人工伤口（尽量确保各个划痕宽度一致）。用PBS冲板3次，加入培养基在培养箱中培养。培养24 h后取出拍照，将划痕的缩短距离用于确定迁移率。

1.5 细胞侵袭能力观察 采用Transwell小室实验。将Transwell小室置于24孔板中，该板用5 mL BD Matrigel预涂覆，并在37 ℃下孵育40 min。将不含FBS的0.1 mL培养基中的2×104个肿瘤细胞接种在上室中。在下室中，加入0.6 mL含有10% FBS的培养基。孵育48 h后，用4%多聚甲醛固定细胞，并用0.1% 结晶紫染色15 min，使用Olympus光学显微镜捕获图像，记录侵袭细胞数。

1.6 细胞PTEN/PI3K/Akt通路蛋白检测 采用Western Blotting法。收集转染48 h后的各组细胞，使用含有新鲜蛋白酶抑制剂的冰冷裂解缓冲液中均质化制备细胞裂解物提取物。在4 ℃以12 000 r/min离心10 min后，获得上清液，测定总细胞蛋白质浓度。将提取的蛋白质通过SDS-PAGE分离，并转移至PVDF膜上。用含有5%脱脂牛奶的TBST闭膜后，将膜与PTEN、PI3K、Akt、p-PTEN、p-PI3K、p-Akt、GADPH一抗一起孵育。漂洗后，将膜在过氧化物酶连接的相应二抗中温育2 h，对蛋白质膜进行染色，使用化学发光进行观察，用BioRad Gel系统定量印迹，使用基于NIH Image的ImageJ定量扫描的染色条带和像素强度，以目的蛋白条带与内参GAPDH条带灰度值的比值表示PTEN、PI3K、Akt、p-PTEN、p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。计量资料采用Shapiro-Wilk进行正态性检验，服从正态分布的资料以±s表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用One-way ANOVA，重复测量资料采用重复测量方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞各时点增殖能力比较 各时点细胞A值比较， miR-92a过表达组＞过表达阴性对照组、降表达阴性对照组＞miR-92a降表达组（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组细胞各时点增殖能力比较（±s）

表1 各组细胞各时点增殖能力比较（±s）

注：与过表达阴性对照组、降表达阴性对照组同时点比较，*P＜0.05。

组别miR-92a过表达组miR-92a降表达组过表达阴性对照组降表达阴性对照组细胞A值24 h 0.687 ± 0.041 0.556 ± 0.032 0.612 ± 0.009 0.602 ± 0.011 48 h 1.239 ± 0.035 0.750 ± 0.033 0.940 ± 0.011 0.917 ± 0.036 72 h 1.806 ± 0.051 0.813 ± 0.075 1.435 ± 0.024 1.362 ± 0.039 96 h 2.730 ± 0.256*1.169 ± 0.077*2.002 ± 0.024 2.062 ± 0.224

2.2 各组细胞迁移能力比较 miR-92a过表达组、miR-92a降表达组、过表达阴性对照组、降表达阴性对照组细胞迁移距离分别为（48.797 ± 2.654）、（22.799 ± 2.368）、（31.737 ± 1.878）、（33.714 ±3.508）μm，miR-92a过表达组＞过表达阴性对照组、降表达阴性对照组＞miR-92a降表达组（P均＜0.05）。

2.3 各组细胞侵袭能力比较 miR-92a过表达组、miR-92a降表达组、过表达阴性对照组、降表达阴性对照组穿膜细胞数分别为（245.333 ± 12.014）、（145.667 ± 9.452）、（177.667 ± 9.074）、（175.000 ±5.196）个，miR-92a过表达组＞过表达阴性对照组、降表达阴性对照组＞miR-92a降表达组（P均＜0.05）。

2.4 各组细胞PTEN/PI3K/Akt通路蛋白比较 p-PTEN蛋白miR-92a降表达组＞降表达阴性对照组、过表达阴性对照组＞miR-92a过表达组，p-PI3K、p-Akt蛋白miR-92a过表达组＞过表达阴性对照组、降表达阴性对照组＞miR-92a降表达组（P均＜0.05），各组PTEN、PI3K、Akt蛋白差异均无统计学意义。见表2。

表2 各组细胞PTEN、PI3K、Akt、p-PTEN、p-PI3K、p-Akt蛋白比较（±s）

表2 各组细胞PTEN、PI3K、Akt、p-PTEN、p-PI3K、p-Akt蛋白比较（±s）

注：与过表达阴性对照组、降表达阴性对照组同时点比较，*P＜0.05。

组别miR-92a过表达组miR-92a降表达组过表达阴性对照组降表达阴性对照组PTEN 0.646 ± 0.029 0.709 ± 0.059 0.765 ± 0.067 0.758 ± 0.083 PI3K 1.066 ± 0.116 0.750 ± 0.122 0.934 ± 0.105 0.966 ± 0.191 Akt 0.988 ± 0.072 0.754 ± 0.076 0.938 ± 0.117 0.933 ± 0.131 p-PTEN 0.209 ± 0.034*0.715 ± 0.035*0.475 ± 0.037 0.480 ± 0.044 p-PI3K 0.796 ± 0.067*0.258 ± 0.018*0.549 ± 0.071 0.565 ± 0.104 p-Akt 0.825 ± 0.016*0.344 ± 0.026*0.620 ± 0.043 0.621 ± 0.006

3 讨论

miRNA是一类高度保守的具有组织特异性的非蛋白质编码RNA，通过负向调控靶基因的表达来维持细胞稳态［8］。研究发现，miRNA的表达与癌症的进展密切相关，其可以发挥致癌基因或者肿瘤抑制基因的作用调节细胞的增殖、迁移和凋亡等多个生物过程。如非小细胞肺癌（NSCLC）相关研究发现，miR-25过表达可以通过靶向FBXW7促进NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭［9］。多项研究表明，miR-92a可以促进肿瘤的发生发展。ZHOU等［10］研究发现，miR-92a在宫颈癌组织中显著上调，且miR-92a过表达可以促进细胞周期从G1期向G2期转变，从而显著增强宫颈癌细胞的增殖和侵袭。TSUCHIDA等［11］研究显示，miR-92a在结肠腺癌组织中表达增加，可直接靶向B淋巴细胞瘤2并抑制结肠癌细胞凋亡；而miR-92a抑制剂可诱导结肠癌细胞凋亡。此外，有研究显示miR-92a-3p在ESCC中过表达，其可以通过调节PTEN的表达促进ESCC细胞增殖、迁移和侵袭［12］。本研究结果表明，过表达miR-92a可提高ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，抑制miR-92a表达可抑制ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

PTEN/PI3K/Akt信号通路可以激活下游多种效应分子，从而调节肿瘤细胞生长、分化、增殖、存活、侵袭、转移，与人类多种恶性肿瘤的发生发展密切相关［7］。PTEN位于染色体10q23上，是一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，可负性调节PI3K/Akt细胞信号从而调控癌症进展［13］。PTEN/PI3K/Akt对癌症的调控作用受到miRNA异常表达的影响，如miR-21能够促进PTEN/PI3K/Akt通路中Akt蛋白的磷酸化，降低PTEN蛋白的表达，进而促进卵巢癌细胞的增殖并减少肿瘤细胞凋亡［14］；miR-671能够靶向抑制circSLC8A1表达，诱导PTEN下调，促进乳腺癌细胞中的PI3k/Akt信号转导，进而促进乳腺癌的发生发展［15］。本研究结果显示，上调miR-92a表达可以显著抑制PTEN蛋白的磷酸化，并促进PI3K和Akt蛋白的磷酸化，进而促进ESCC细胞增殖、迁移及侵袭。

综上所述，miR-92a可促进ESCC细胞的增殖、迁移及侵袭，其作用可能通过抑制PTEN蛋白磷酸化调控PTEN/PI3K/Akt信号通路实现，这也提示miR-92a可能作为ESCC治疗的潜在靶点。本研究仍有一定不足之处，本研究仅探究miR-92a对ESCC细胞生物学行为以及PTEN/PI3K/Akt信号通路的影响，并未深入探究miR-92a靶向调控基因进行深入挖掘，未来将针对miR-92a的调控机制进行进一步探究。