舌下免疫治疗变应性鼻炎疗效预测生物标志物研究进展①

邹 琪 申 琪 郭向东 （河南中医药大学，郑州 450000）

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是发生在鼻黏膜的由IgE 介导的Ⅰ型变态反应，是最常见的过敏性疾病之一，近年来，我国AR 患病率不断升高，成人自报的标准化患病率从2005 年的11.1%上升至2011 年的17.6%［1-2］。AR 不仅严重影响了患者的学习、工作效率和生活质量，而且是哮喘的危险因素［3-4］。如何有效治疗AR，已经成为当前研究热点。目前AR 的治疗主要包括避免接触变应原、药物治疗和变应原特异性免疫治疗（allergen specific immunotherapy，AIT）。根据给药途径不同，AIT 分为皮下免疫治疗（subcutaneous immunotherapy，SCIT）和舌下免疫治疗（sublingual immunotherapy， SLIT）。AIT能有效改善患者的鼻部症状，同时被国际公认为唯一可能改变疾病自然进程的治疗措施，可以预防哮喘的发生［5-6］。相比于SCIT，舌下给药途径更便捷，同时研究表明其不良反应事件的发生率更低，对于AR 的患者尤其是儿童，安全性更高［7-8］。AIT推荐疗程为3年，而过长的周期会导致患者依从性降低、经济负担加重［9］。因此在治疗前进行疗效预测、治疗中进行疗效评估十分重要，但是至今尚无公认的客观生物标志物。近几年AIT疗效相关的生物标志物的研究众多，对于个性化医疗具有重要意义。本文主要对近10 年关于SLIT 疗效预测的候选生物标志物的研究加以总结和论述。

1 免疫治疗前

1.1 血清变应原特异性IgE 血清变应原特异性IgE（antigen-specific IgE，sIgE）不仅与AR 的发生机制密切相关，对于治疗前预测免疫治疗的疗效也具有重要意义。sIgE 在AR 的诊断中具有重要作用，是启动AIT 的纳入标准之一［10-12］。研究表明：血清sIgE 数值与SLIT的有效应答有关，对SLIT有积极反应的患者血清sIgE 水平显著高于对SLIT 无反应的患者［13-14］。CIPRANDI 等［15］通过3 年的真实世界研究，对尘螨或草花粉过敏的75 例成人AR 患者进行舌下滴剂治疗，根据视觉模拟量表（visual analogue scale，VAS），与基线（开始SLIT 前）相比，将评分下降至少30%的患者定义为应答患者，结果显示：应答组的血清sIgE 水平显著高于无应答组，ROC 曲线分析认为：sIgE 浓度大于14.3 kUA/L 是区分应答者和非应答者的最佳阈值；其另一项3 年的回顾性研究［13］，SLIT 治疗对象为对草花粉或尘螨等过敏的174例AR 患者，以同样标准，定义145例（83.3%）为应答患者，经ROC 分析，治疗前患者血清sIgE 水平高于9.5 kUA/L作为可能预测屋尘螨过敏AR患者有效SLIT 的范围。另一项儿科研究进一步证明了这一观点，除1例报告了严重反复呼吸道感染的儿童，sIgE 水平高于10 kUA/L 的儿童免疫治疗后，都表现为过敏症状的改善和药物使用的减少［16］。不足的是，上述两项研究缺乏足够的对照，需要对更大队列进行严格的前瞻性试验来验证血清sIgE 的预测作用。最新一项研究发现，对屋尘螨或粉尘螨过敏的SLIT 效果满意患者血清sIgE 基线值均显著高于治疗效果不满意的患者［17］。另一方面，sIgE水平可能与鼻部过敏性疾病的严重性相关，症状较重的患者的血清sIgE 水平高于症状轻的患者，对AIT 的反应优于鼻部症状较轻的AR 患者［11，18-19］。故sIgE 可能有助于治疗前预测疗效，选择适合免疫治疗的患者。

1.2 sIgE/血清总IgE（total IgE，tIgE） 此外，血清sIgE/tIgE 可能也与疗效预测相关，但相关研究颇具争议。早期FUJIMURA 等［20］的实验表明较低的比值可能是SLIT 有效性的预测指标，OKAMOTO 等［21］通过一项多中心、随机、双盲、安慰剂对照试验发现：sIgE 与tIgE 的比值在有应答者的SLIT 组和症状轻微的安慰剂组中都较低。但一项对AR 儿童SLIT的临床试验则提示血清sIgE、sIgE/tIgE 与临床疗效呈正相关，血清sIgE/tIgE 的ROC 曲线表明，超过12.6%时，对预测短期疗效的敏感度和特异度分别为97.2%和74.1%［14］。另一项最新的相关研究中，KIM 等［17］同样发现血清sIgE/tIgE 与SLIT 疗效满意度正相关。有趣的是，有研究显示有效组和效果较差组的sIgE/tIgE 无显著差异，该值无法预测SLIT 的疗效［22］。不难发现，近些年对sIgE/tIgE 与SLIT 疗效相关性的研究数量较少，明显少于SCIT 的相关研究。未来需要进行更多、更大队列、更严格的随机对照试验来了解sIgE与tIgE的比值与有效应答的相关性，以进一步明确是否可以作为SLIT 疗效预测指标。

2 免疫治疗期间

2.1 血清IgE 的抑制活性 血清IgE 抑制活性与SLIT 的临床效应正相关，作为阻断免疫抗体的功能指标，IgE 易化变应原结合（IgE-facilitated allergen binding，IgE-Fab）的抑制活性和IgE 阻断因子（IgEblocking factor，IgE-BF）活性升高对治疗期间评价SLIT的疗效具有参考意义。目前发现AIT可诱导血清中IgE 的相关抑制抗体或抑制因子活性增强，包括两方面：阻止变应原与IgE 结合、阻止IgE-变应原复合物与B 细胞结合［23］。检测方法有IgE-BF 试验，IgE-Fab 试验。RENAND 等［24］完成了一项针对花粉过敏患者为期3 年的随机对照试验，期间进行多模式的免疫检测，发现SLIT 的第2 年和第3 年的血清IgE 抑制活性提高，虽在第3 年抑制活性开始降低，但都高于治疗前的水平，且治疗期间对IgE-Fab 的抑制活性均显著高于安慰剂组。一项SLIT 和SCIT对花粉过敏患者的免疫比较试验的结果显示：花粉片剂治疗组在3个月后IgE阻断因子活性逐渐升高，并显著高于对照组，在治疗结束时该数值达0.27［25］。DIDER 等［26］对SLIT 尘螨过敏患者的最佳维持剂量的研究发现，三种剂量的屋尘螨和粉尘螨片剂给药后，IgE 阻断因子都呈升高趋势，但该试验只监测了治疗6个月的血清IgE的抑制活性变化，且缺乏症状和药物评分来确定有效反应者，无法确定IgE 阻断因子与疗效的相关性，需要其他更长疗程的SLIT 相关试验来验证IgE-BF 是否与治疗后有效应答相关。最新的一项双盲、双模拟、安慰剂对照试验，比较SCIT和SLIT两年以及停止治疗一年后的鼻腔及血液的梯牧草花粉特异性抗体反应［27］：与安慰剂组相比，SLIT 组的血清在第2 年和第3 年阻断了过敏原-IgE复合物与B细胞表面的CD23结合。

2.2 IgG IgG 作为“封闭抗体”，不仅可以与IgE 竞争性结合变应原，防止进一步效应细胞的激活和脱颗粒，而且可以抑制变应原-IgE 复合物与B 细胞表面的FcεⅡ受体结合［28-30］。IgG 与SLIT 临床效应之间的关系仍是一个有争议的问题。国外研究发现，与安慰剂组或对照组相比，经SLIT 治疗后AR 患者血清变应原特异性IgG4（antigen-specific IgG4，sIgG4）有显著变化，且该水平上升［31-32］。另一项对单敏和多敏患者的治疗结果显示，治疗后sIgG4 均较前显著升高，不足的是该研究未设置对照组［33］。一项大型的随机、双盲、安慰剂对照试验显示［34］：粉尘螨sIgG4 水平在治疗后12 周内显著升高，后期小幅度上升，而安慰剂组无明显变化。另一项研究也有类似免疫学变化：过敏性鼻炎儿童免疫治疗后，IgG1和IgG4较基线值且对比安慰剂组明显提高，差异具有统计学意义［35］。西班牙学者发现，经舌下片剂治疗的患者sIgG4 水平在前4 个月的升高与检测到的血清sIgE、IgE-Fab 和IL-4 的下调以及患者的主观临床症状改善密切相关［36］。KIKUOKA 等［37］对联合花粉症的SLIT治疗结果显示：过敏原为cryj1的雪松花粉症的治疗组IgG4 显著升高，与鼻部症状和药物评分呈负相关。出现类似sIgG4 变化的还有国内的几项研究［38-39］。此外，不少研究则发现SLIT 疗效与血清特异性IgG水平无相关性：POTTER等［40］的对照试验中治疗组特异性IgG无明显变化，OKAMOTO等［21］和XIAN 等［41］发现sIgG4 水平与症状严重程度或治疗效果无关。有研究则显示治疗组和对照组sIgG4 水平都显著升高，且无数据显示sIgG4 的升高与症状改善的相关性［42］。上述试验结果各异的原因可能是，血清sIgG 值的变化是免疫水平变化，不能完全代表其阻断抗体的作用，还应关注抗体阻断变应原与效应细胞表面sIgE 结合的竞争能力，如SHAMJI 等［43］研究发现：相比于sIgG，免疫治疗后血清抑制活性的功能性测定可能比血清sIgG4 水平更能预测免疫治疗的临床反应。因此，IgG 可能通过竞争性抑制IgE与变应原结合，血清IgG水平升高可能与疗效相关，能否作为疗效评估的生物标志物需要进一步验证。

2.3 免疫细胞

2.3.1 调节性T 细胞（regulatory T，Treg） Treg 及其细胞因子抑制Th2 型免疫反应，有利于产生免疫耐受，Treg 细胞水平升高可能对疗效评估具有积极作用［44-45］。Treg 细胞被分为两个亚群，以高表达转录因子Foxp3 和表面分子CD25 为特点的天然型Tregs 细 胞（nature regulatory T，nTregs）和 诱 导 型Tregs细胞（inducible regulatory T，iTreg），亚型有Tr1、Th3，iTreg-35，产生抑制性细胞因子如IL-10、IL-35、TGF-β［46］。一项针对尘螨过敏患者的两种免疫治疗的比较研究发现，SLIT 组的CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的变化与鼻炎总评分成反比（P=0.024）［41］。一项对草花粉SLIT治疗前和治疗2年期间收集的鼻液免疫学指标的研究表明，AIT 的成功主要与鼻黏膜中IL-35 型iTreg 细胞反应有关［47］。SWAMY 等［48］研究发现，SLIT 组的受试者Foxp3 位点CpG 甲基化减少，对应的记忆Treg 细胞中Foxp3转录水平升高，而安慰剂组受试者中无此变化，提示Treg 细胞对SLIT 的长期耐受诱导起促进作用。一些学者持相同观点：认为iTreg 细胞的亚型上调与SLIT 临床疗效相关，可以作为疗效预测的潜在生物标志物［20，49-51］。此外，一项为期4 年针对雪松花粉变应原的SLIT实验证明了Foxp3+Treg细胞对过敏原的长期耐受作用［52］。

2.3.2 嗜碱粒细胞 嗜碱性粒细胞反应的量化可能是潜在生物标志物，通过测定该活性可以评估AR 的免疫治疗效果。嗜碱粒细胞表达FcεRI，它可以在过敏原暴露后被过敏原特异性IgE 交联，导致脱颗粒并释放组胺、白三烯和其他过敏性介质，引起相应的炎症反应。嗜碱粒细胞活性的常用测定包括：①在单细胞水平上测定全血嗜碱粒细胞内荧光标记的二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）以检测组胺释放［53］。②通过测定嗜碱粒细胞表面活性标志物如CD63、CD203c、CD107a 以检测嗜碱粒细胞活性［54］。一项临床试验通过观察为期2年的舌下和皮下同步免疫治疗和停药后1 年的免疫学变化，结果显示［24］：两种疗法都显著抑制了草花粉变应原诱导的嗜碱性细胞表面CD63 表达，且较安慰剂组有显著差异，这一效应在停药1 年后的第3 年随访中持续存在。SHAMJI 等［55］不仅证明了两种免疫治疗的CD63 嗜碱粒细胞比例明显低于对照组，同样肯定了CD203c、CD107a 以及DAO 表达活性与免疫治疗抑制作用的关系，且鼻结膜炎总症状评分与细胞内标记的DAO 和CD63 嗜碱性细胞比例显著正相关。有趣的是，最近的一项对照试验中嗜碱性细胞活性试验（basophil activation test，BAT）显示［37］：与对照组相比，SLIT 组的CD203c 活性被抑制，但无显著差异。有学者认为，外周血嗜碱性粒细胞的反应不是早期临床反应的生物标志物［56］。因此，结果出现差异的原因可能是BAT 需要较长的治疗时间后才会出现显著差异，血液中的嗜碱粒细胞活性不能等同于局部鼻黏膜的反应。KIM 等［57］发现，对尘螨过敏的老年AR 经SLIT 1 年后，嗜碱性粒细胞CD203c表达显著降低，而对照组则无明显变化。一些研究同样显示了嗜碱粒细胞活性降低与SLIT 疗效的相关性［25，48，58］。

2.3.3 树突状细胞（dendritic cells，DCs） 区别于皮下AIT，SLIT 的舌下黏膜免疫机制和围绕DCs 的靶向SLIT 是当前的一大研究热点。研究认为，DCs参与SLIT 的过程为：捕获过敏原并将其加工成抗原肽，提呈给T 细胞，同时CD4+T 细胞分化为Treg 细胞，通过IFN-γ、IL-10 和TGF-β 的变化调节细胞免疫［59］。一项横断面研究，研究者对尘螨过敏的AR患者分别进行SLIT 和SCIT 治疗，监测到外周血DCs亚群中组蛋白甲基化转移酶（EZH2）的表达与AIT的治疗时间呈负相关，认为该酶的表达可能与疗效相关［60］。由于该研究未评估患者症状，两者关系还有待考证。GUEGUEN 等［61］通过监测花粉症患者SLIT 治疗前、2 个月后、4 个月后外周血单核细胞中多种DCs 的20 余种基因和蛋白质的表达，同时计算平均鼻结膜炎总症状评分改善百分比，发现DCs 某些表达标志物与SLIT 疗效具有相关性，认为根据DCs的相关标志物的表达，最早可在AIT后2个月用于监测疗效。早期一项类似研究也认为DCs的补体C1Q 和受体stabilin-1 可以在免疫治疗早期预测疗效［62］。目前AR 的SCIT 领域，已经有不少DCs 的相关动物实验研究及临床研究，SLIT 的临床试验还较少，对于SLIT 中DCs 的作用机制，及DCs 与SLIT 疗效的相关性研究还有待完善。

2.4 白细胞抗原Ⅱ类分子（leukocyte antigen class II，HLA-Ⅱ）相关基因 HLA-Ⅱ主要表达于B 淋巴细胞、巨噬细胞、DCs，将抗原肽传递给T 细胞受体，启动适应性免疫过程。据报道，HLA-Ⅱ基因（HLADRB1、HLA-DQB1）多态性与过敏性疾病相关［63］。有 两 项 研 究 发 现HLA-DRB1*08：03：02、HLADQB1*06：01：01 等位基因的多态性可能是我国尘螨过敏型AR 发病的风险因素［64-65］。有学者通过检测与人类HLA-DRB1 基因同源的AR 小鼠和健康小鼠基因H2-EB1 蛋白和H2-Eb1 mRNA 表达情况，以及两组小鼠血清sIgE、IFN-γ、IL-4 水平，得出结论：AR 小鼠体内出现Th1/Th2 细胞因子失衡，HLADRB1基因对AR 的Th1/Th2反应失衡起重要调节作用［66］。一项针对尘螨过敏AR 患者的SLIT，证实了HLA-DRB1 和HLA-DQB1 基因多态性与AR 患者AIT 疗效相关性［67］。因此，HLA-Ⅱ基因的多态性可能是AR患者对AIT差异应答的重要机制，未来进行更多HLA-Ⅱ基因表达与AIT 相关的前瞻性随机对照研究十分必要。

2.5 细胞因子 不少研究发现，AR 患者舌下免疫治疗前后多种血清细胞因子发生显著变化，可能与免疫治疗机制相关，如IL-35、TGF-β 的上调，IL-4、IL-17、IL-33 的下调。细胞因子在介导AR 疾病进程中起着重要作用，Th2 细胞因子（IL-4、IL-5 和IL-13）促进IgE 的产生以及肥大细胞、嗜酸性粒细胞的分化；IL-4、IL-5、IL-13 水平的降低，Treg 细胞产生的IL-10 和TGF-β 水平的升高，可抑制AR 的炎症反应［68-70］。IL-35 是IL-12 家族中新发现的成员，不同于其他促炎分子，主要由iTreg 细胞和Breg 细胞分泌，属于抗炎和抑制性细胞因子，IL-35 和IL-35 型iTreg 细胞的作用是：抑制变应原诱导的T 细胞增殖、Th2 细胞因子的产生和B 细胞分泌IgE，以及诱导IFN-γ和IL-10的产生［71-73］。早期的一项研究发现SLIT 可能是通过降低IL-17 和促进IL-35 的表达水平起效［74］。SHAMJI 等［47］进行的3 年草花粉舌下片剂治疗AR 的临床对照试验发现：IL-35型iTreg 细胞产生的IL-35可以抑制过敏症患者的Th2免疫反应，抑制B 细胞产生sIgE，并且SLIT 组的IL-35 和IL-35型iTreg 细胞数值高于SAR 对照组及非特异性对照受试组，且与鼻结膜总症状评分呈负相关。此研究不同于其他小鼠模型研究，是在人体血清中发现IL-35 对多种Th2 细胞因子的抑制作用及抗炎作用，但此研究样本量较小，需要在更大队列中进行验证［75-76］。另一项对尘螨过敏AR 患儿进行SLIT 治疗结果显示［14］：相较于治疗无效患者，303 例症状改善的儿童IL-10、IL-35、TGF-β水平升高，与临床疗效相关，对预测短期疗效有临床意义。针对屋尘螨过敏原的单敏和多敏患者的免疫治疗结果显示，两组治疗后TGF-β 水平都明显升高［77］。国内学者通过实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测免疫治疗前后外周血单核细胞中TGF-β 和IL-13 mRNA 表达水平的变化，结果显示症状改善的患儿TGF-β mRNA 表达水平升高，IL-13 mRNA 表达水平下降，提示该指标可用于疗效预测［33］。SUÁREZ 等［36］通过分析患者外周血样对免疫治疗的体液和细胞免疫反应，认为除阻断抗体水平，IL-4 水平的降低也可作为有效免疫应答的指标。LI 等［78］研究发现患者血清IL-17 在3 年SLIT 后显著降低，且与症状用药积分显著正相关。一项针对屋尘螨过敏原的儿童SLIT 研究，发现IL-33 表达抑制与Th2 应答减弱及Th1 应答增强相关，并经体外实验证实其对Th2 细胞因子的直接作用［79］。此外，有研究也发现了实施免疫治疗后细胞因子的变化，如IL-10、TGF-β 水平升高，IL-4、IL-13水平下降，但都缺乏与临床症状改善的关系验证［80］。

综上所述，近些年关于AR SLIT 疗效预测生物标志物的研究中，不少免疫细胞、细胞因子、免疫球蛋白都被发现与AIT的耐受机制相关，如Treg细胞，调节性B 细胞，IL-35、TGF-β、IgG4、IgA 等。本文主要综述了研究数量较多，且检测方法简便可行的候选生物标志物。从近些年的研究中不难发现，大多数研究都是单一检测某一种或某一类免疫指标的变化，而很少横向对比血清中免疫细胞、特异性抗体、细胞因子的变化，不能很好地筛选出与疗效最相关的生物标志物。此外，不少研究只是简单检测了指标的数值变化，却没有验证其是否与患者症状改善具有相关性。有的研究的局限性则体现在研究的样本量少、疗程短。未来需要更多的大队列、多中心、长期的随机对照安慰剂试验来验证这些生物标志物的有效性。越来越多的研究从分子表达水平探索，例如利用实时定量聚合酶链反应（qRTPCR）检测了SLIT 后AR 患儿外周血单核细胞中TGF-β 和IL-13的mRNA 表达，评估其是否为疗效评估指标。有试验研究嗜碱性粒细胞DPF2 基因的遗传变异及mRNA 水平评估SLIT 的有效性。不少研究则利用组学技术了解SLIT 引起的系统效应，这对于AIT 疗效预测研究具有重要意义：明确的AIT 机制有利于指导不同时期的免疫指标的疗效相关性研究。