革兰氏阳性菌细胞外囊泡研究进展①

徐兆坤 李 敏 罗海霞 （宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，银川750021）

细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是一种由活细胞分泌，具有脂质双层结构，无法复制的纳米级颗粒［1］。EVs 最初在真核生物中被发现，携带蛋白质、核酸和脂质等多种物质，根据大小、生物特征及形成过程被分为外泌体、微囊泡和凋亡小体［2］。近年来的研究显示，来自古细菌、细菌和真核生物三大生命领域的细胞都能够分泌EVs［3］。细菌按细胞壁结构差异可分为革兰氏阴性菌（G-菌）和革兰氏阳性菌（G+菌）。G-菌的细胞壁由两层被周质空间隔开的内外两层脂膜组成，而G+菌仅有一层脂膜并且被厚层肽聚糖和磷脂壁酸组成的细胞壁包围［4-5］。20 世纪60 年代，人们从G-菌大肠杆菌中发现了EVs，有研究者认为G-菌的EVs 是通过外膜挤压产生的，因此称其为外膜囊泡（outer-membrane vesicles，OMVs）［6-9］。由于G+菌缺少外膜且存在厚细胞壁，G+菌一度被认为无法产生EVs，直到1990 年才出现关于G+菌产生EVs的研究报道［10］。G+菌产生的EVs 一般被称为膜囊泡（membrane vesicles，MVs），之后科学界统一将其规范命名为EVs［1］。

近年来G+菌来源的EVs（G+-EVs）引起了广泛关注，多项研究表明金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、痤疮丙酸杆菌及单核增生李斯特菌等G+菌均可分泌EVs［11-14］。与真核细胞和G-菌分泌的EVs 类似，G+-EVs同样包含蛋白质、核酸、脂质及代谢产物等生物活性分子，直径为20～500 nm［15］。然而不同菌属来源的EVs 直径大小、组成、生物发生及功能存在差异，这表明EVs的分泌虽然是一种保守的生物现象，但仍具有物种特异性［3，16］。因此推进G+-EVs 的研究进程对于全面理解EVs在细胞生命历程中的地位有重要的意义。大量的研究表明G+-EVs 在生物膜形成、水平基因转移（horizontal gene transfer，HGT）、耐药性及对宿主细胞免疫调节等方面扮演了重要角色，在疫苗开发、相关疾病治疗以及药物递送等领域也具有重要的潜在应用价值［17-22］。本文对近年来G+-EVs 在生物发生、组成、功能及应用等方面的研究进行综述，以期为相关研究提供参考。

1 G+-EVs的生物发生

有研究者认为细菌EVs 可能是菌体死亡裂解后，脂膜自发形成的囊泡结构，随后有研究者用热灭活细菌进行的实验证明了EVs的形成依赖于具有新陈代谢活性的细胞，这说明EVs 的形成是活性细胞生命活动中的正常生理过程［14，23-25］。大量关于G-菌的研究显示，G-菌分泌EVs受多种基因的调控，大肠杆菌分泌EVs 的过程涉及至少100 个基因，这也提示G+-EVs 的生物发生也极有可能由一个复杂的调节网络调控［26-29］。LEE 等［30］研究发现，在单核细胞增生李斯特菌中，转录因子σB（transcription factor σB，sigB）基因缺失突变株EVs 分泌减少，且其形态与野生株分泌的EVs存在差异。变形链球菌中编码4'-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶的sfp基因、表面活性素合成酶同系物基因bacA、二腺苷酸环化酶编码基因dac及磷酸二酯酶编码基因pdeA的缺失均可显著增加变形链球菌EVs 的产量，而与之相反的是杆菌肽合成酶同系物基因bacA2的缺失导致变形链球菌EVs的产量显著降低［31］。还有研究证明A组链球菌中双组分系统CovRS 也具有调控EVs 形成的功能［25］。不同的物种还可能存在物种内特定的基因调节EVs 的形成，酚溶性调节蛋白（phenol soluble modulins，PSM）是一类具有表面活性剂活性的蛋白家族，可分为α 型和β 型。金黄色葡萄球菌缺失了psmα后，其培养上清中的EVs 显著减少，说明psmα对于金黄色葡萄球菌分泌EVs 具有重要调节作用，而psmβ却没有这种功能［32］。更有趣的是，虽然在其他葡萄球菌中也存在psmα，但目前的结果显示psmα仅在金黄色葡萄球菌中具有调节EVs 的功能［32-34］。作为高度保守的调节因子sigB可能在G+-EVs 的产生中发挥了关键作用，但尚无法确定是否存在保守的EVs 调节基因或系统适用于绝大多数G+菌，上述研究都表明G+-EVs 的产生确实是一种涉及多基因的复杂调控系统。除了基因调控，环境条件的变化对EVs 的产生方式也存在影响。NAGAKUBO 等［35］研究发现含分枝杆菌酸的谷氨酸棒杆菌响应不同的环境条件，通过不同途径形成不同类型的EVs。在丝裂霉素C（MMC）处理下，谷氨酸棒杆菌通过内溶素（肽聚糖降解酶）触发的细胞裂解诱导EVs的形成；在添加青霉素或缺少生物素的生长条件下，谷氨酸棒杆菌包膜结构发生改变，进而诱导谷氨酸棒杆菌通过菌膜起泡形成EVs，更重要的是这些途径在其他含霉菌酸的细菌（如耻垢分枝杆菌、红球菌）中是保守的［35］。

由于G+菌细胞壁的特性，EVs 产生后如何穿过厚的细胞壁分泌到细胞外这个问题仍未得到准确的解释。目前，关于G+-EVs 释放到外界的方式存在三种观点：①G+-EVs 从质膜上释放后，可能因膨胀压力而被迫穿过细胞壁，这种情况下，G+-EVs 的释放受到细胞壁孔径和厚度的调节。金黄色葡萄球菌膨胀压力的降低减少了EVs 的释放，这表明低渗环境可在囊泡分泌过程中发挥重要作用［36］。②随G+-EVs 释放的细胞壁修饰酶可通过改变细胞壁状态释放EVs。G+菌细胞壁稳态依赖于合成和降解的平衡，由转肽酶（penicillin-binding proteins，PBPs）和自溶素等蛋白协调［37-38］。蛋白质组学结果显示，金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌及痤疮丙酸杆菌所分泌的EVs 都包含PBPs 和自溶素［39-41］，金黄色葡萄球菌中PBPs 的缺陷导致EVs 产量增加，而自溶素突变导致EVs大小发生变化［32］。这表明细胞壁修饰在囊泡释放中可能起着关键作用。③G+-EVs 可以发生形态改变，可能通过比EVs 直径更窄的通道，G+-EVs 可经通道进而被释放［4］。由于起步较晚，G+-EVs 生物发生的相关研究仍然较少，其生物发生机制仍待阐明。

2 G+-EVs的组成

EVs 中包含多种组分，合适的EVs 分离纯化方法对于解析EVs 的组成至关重要，差速超速离心结合密度梯度离心的方法仍是目前最被认可和采用的G+-EVs 分离提取方案［39，42］。除此之外，也可采用差速离心结合尺寸排阻色谱法或其他方式分离EVs。与G-菌来源EVs 类似，G+-EVs 中同样包含蛋白质、核酸及脂质等具有生物活性的分子［16］。不同细菌来源的EVs 中包含物存在显著差异，甚至同一种菌在不同培养条件下分泌的EVs 其内容物也同样存在差异［43］。

2.1 蛋白质 LEE 等［39］首次在金黄色葡萄球菌分泌的EVs 中鉴定出90 种蛋白质，其中大部分是细胞质蛋白。之后另外的研究者进一步分析了金黄色葡萄球菌分泌的EVs，表明与EVs 相关的蛋白质超过200种，其中160种是细胞质蛋白质［45］。EVs携带的蛋白既可以包裹于EVs内部又可以锚定在EVs的膜上，根据EVs 的起源，EVs 膜相关蛋白应该来自于细胞质膜，而EVs 内的蛋白则应该是在EVs 发生过程中包装的细胞质蛋白［11，46］。有研究显示，EVs、全菌及细菌细胞膜之间蛋白组成存在差异［25，47］。在A组链球菌EVs 所包含的蛋白中，有3 种是EVs 所特有的［25］。枯草芽孢杆菌中，有30 种蛋白质只与EVs相关，而与细菌细胞无关［48］。单核细胞增生李斯特菌的蛋白质组成分析显示，296 种蛋白质存在于全细胞中，16种蛋白质仅存在于EVs［49］。除此之外，在不同培养条件下，相同菌株产生的EVs 中蛋白质组成也存在较大差异，这说明可能存在特定的分选转运机制，将不同的蛋白整合至EVs［11，14，25，47，50］。EVs蛋白的功能分析表明，EVs 中常见的蛋白质类型与细菌能量产生、营养吸收以及翻译等代谢过程相关［40-41，51］。然而这些蛋白的具体作用目前报道仍然较少。比较有趣的是，对于一些致病性G+菌，某些毒力蛋白在EVs 中被富集，比如单核增生李斯特菌EVs富集了李斯特菌溶血素O（LLO），金黄色葡萄球菌EVs富集了α-溶血素（Hla），毒力蛋白在EVs中的存在影响了致病菌感染宿主的过程，这也说明EVs是致病菌毒力组成中的重要部分［14，52］。

2.2 核酸 目前关于EVs 携带核酸的报道主要来自于G--EVs，已经证明在G--EVs 中存在DNA 和RNA（如mRNA、rRNA和tRNA），而G+-EVs中携带核酸的报道仍然较少［53］。WEN 等［31］发现变形链球菌EVs 携带DNA，这些DNA 主要分 布 于EVs 表面，RESCH 等［25］发现化脓性链球菌EVs 携带了多种RNA。EVs 中的核酸来源于原菌体，但与全菌细胞相比可能存在显著差异，B 组链球菌来源的EVs 携带DNA，其中包括成孔毒素编码基因cfb，但并未检测到其他毒力基因或管家基因［54］。相对于细菌细胞，化脓性链球菌EVs中207种RNA存在差异，其中120种RNA 转录产物在EVs中丰度更高［25］。这似乎显示EVs 可以有选择地包装细胞基因，并将其分泌至细胞外。与这些研究不同的是，WANG 等［55］发现革兰氏阳性菌Dietzia sp.DQ12-45-1b 产生的EVs 中同样包含DNA，测序结果显示EVs中的DNA 组装长度为3 792 433 bp，覆盖了全菌基因组的99.23%，这些结果说明EVs可以作为载体包装几乎整个细菌基因组，这些基因组基因可能进一步转移到其他细胞中，提示G+菌可能存在未知的机制调控EVs 中的核酸组成和运输。包含在EVs中的核酸对于致病菌的毒力同样十分重要，金黄色葡萄球菌EVs 中含有DNA 和sRNA，具有激活宿主细胞模式识别受体的能力，并促进上皮细胞释放细胞因子和趋化因子［56-57］。这进一步说明了病菌致病过程的复杂性以及EVs在此过程的重要性。

2.3 脂质 脂质是EVs的重要组成，但不同种属来源的EVs所携带的脂质含量或种类均存在差异。脂质组学分析表明，炭疽芽孢杆菌EVs 富含肉豆蔻酸和棕榈酸，肺炎链球菌EVs富含短链饱和脂肪酸，单核细胞增生李斯特菌EVs富含磷脂酰乙醇胺和鞘脂等不饱和脂肪酸［14，40，58］。短链饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸会影响膜曲率和膜流动性，脂肪酸种类和含量的差异可能会影响EVs 在G+菌中的释放过程，但这些脂质成分的具体作用则需要进一步探究。

2.4 其他成分 除了蛋白质、核酸以及脂质外，G+-EVs 还携带其他生物活性分子，如肽聚糖、鸟氨酸、柠檬酸盐、肌醇等物质［16］。CAO 等［59］对酸性条件下变形链球菌EVs中代谢物进行分析，发现甜菜碱、海藻糖和左旋肉碱等压力保护剂在EVs 中上调，这为探究G+菌在环境压力下的存活机制提供了参考。目前关于G+-EVs 中糖类物质和代谢产物相关功能的研究还处于起步阶段，是一个需要进一步探索的领域。

3 G+-EVs的功能

多项研究显示G+-EVs 的功能主要由其携带的酶、脂蛋白、核酸以及各种毒素决定，包括参与细菌生物膜形成、HGT 及抗生素抗性等生理过程，也参与致病菌感染期间对宿主细胞的免疫调节过程［14，45-47］。

3.1 生物膜形成 生物膜被认为是环境中微生物的重要状态，赋予细菌抵御外界极端环境的生存能力，并促进细菌在宿主体内定植［18，60］。G+-EVs 携带的成分：细胞外DNA（eDNA）、黏附相关蛋白以及脂质等均可参与生物膜的形成［61-62］，向培养基中添加变形链球菌EVs 后，显著增强了变形链球菌的生物膜形成［31］，更有研究者成功从枯草芽孢杆菌和罗伊氏乳杆菌生物膜中分离出EVs［48，63］。eDNA 是生物膜基质的重要部分之一［64］，LIAO等［65］证明变形链球菌可以产生携带eDNA 的EVs，WEN 等［31］进一步研究发现变形链球菌EVs 携带的eDNA 存在于EVs 表面，pH升高导致了变形链球菌生物膜细胞外基质蛋白的释放，但当变异链球菌生物膜用DNaseⅠ处理后，没有观察到这种现象，这表明eDNA 和蛋白质在变形链球菌生物膜内相互作用，并且eDNA 的存在可以显著减少细胞外基质蛋白的释放，这也间接说明携带了eDNA 的EVs 在生物膜的形成和稳定性中的作用。更有趣的是变形链球菌中的EVs不仅有利于其自身生物膜的形成，而且有助于白色念珠菌生物膜的形成［66］。然而与之相反的是，杨丽玉等［67］在研究中发现，来自单核增生李斯特菌的EVs 对其自身生物膜的形成具有显著的抑制作用，不同基因突变株来源的EVs均可表现出对生物膜形成的抑制作用，并且这些EVs 对自身菌生物膜形成的抑制作用最为显著。群体感应（quorum sensing，QS）是细菌适应高密度生存的策略之一，产生称为自诱导剂的群体感应分子有助于细菌黏附和生物膜形成［21］。在金黄色葡萄球菌中，群体感应相关的agr基因座控制细菌EVs 蛋白和毒力因子的组成，表明agr基因座与EVs 产生以及生物膜形成之间的联系［39，68-69］。这些研究充分说明EVs在生物膜形成的过程具有复杂的调控机制，而不仅仅作为组成参与其中。

3.2 耐药性 细菌通常对抗生素敏感，但作为适应性反应的一部分，在一些条件下细菌可能会产生耐药性，EVs 在此过程中发挥了重要作用［70］。来自枯草芽孢杆菌的EVs 富含Sun Ⅰ蛋白（也称为YolF），赋予枯草芽孢杆菌对羊毛硫抗生素的抗性，而EVs中脂肽抗生素表面活性素的存在使EVs不稳定，导致EVs中的活性分子被释放出来，可能有助于枯草芽孢杆菌耐药性的形成［48，71］。对链霉素敏感的单核细胞增生李斯特菌产生的EVs能够以剂量依赖性的方式保护单核细胞增生李斯特菌免受抗生素甲氧苄氨嘧啶和链霉素的杀伤作用，使其能够在链霉素存在下存活［19］。蛋白质组学分析表明，金黄色葡萄球菌EVs 含有一种降解β-内酰胺所需的酶BlaZ［39］，EVs 通过酶降解环境中β-内酰胺类抗生素从而达到耐药的目的［72］，而β-内酰胺类抗生素如氟氯西林和头孢洛林的使用会进一步增加金黄色葡萄球菌EVs 的产量。因此，EVs 通过转运抗生素抗性因子在细菌耐药性产生中发挥重要作用。

3.3 HGT HGT 又称为侧向基因转移（lateral gene transfer，LGT），指生物将遗传物质传递给其他细胞而非其子代的过程。HGT 通过遗传物质的移动、抗生素抗性和毒力因子的传播等过程，在许多生物体的进化中发挥着重要作用。在细菌中，除了转化、转导和接合外，携带核酸的EVs 在细胞之间的融合是HGT 的另一种机制，并已在G-细菌中被证明［18，73］。有报道显示，存在EVs 介导的从鲍曼不动杆菌、贝氏不动杆菌和铜绿假单胞菌向大肠杆菌细胞的基因转移［74］。EVs在物种间基因转移的潜力取决于受体物种吸收和维持水平获得的核酸的能力，短的线性染色体片段和重复的DNA 序列被包装至EVs以便输出到细胞外［75］。纤维素分解瘤胃球菌类囊泡颗粒携带双链DNA，这些与类囊泡颗粒相关的DNA 主要是大小在20～90 kb 的线性分子群，使用瘤胃球菌属的培养物上清液中含有囊泡的部分进行转化，恢复了突变菌株YE71 降解结晶纤维素的能力，这种能力可以遗传并传递给后代［75］。通过EVs进行的基因转移是细菌耐药性形成的重要因素，细菌的抗生素抗性基因可以通过EVs 转移到其他细菌。例如大肠杆菌分泌携带抗生素黏菌素、蜂毒肽抗性基因的EVs 处理后，使铜绿假单胞菌和抗辐射不动杆菌也获得了相应的耐药性［76］。同样，G+-EVs也含有多种基因，极可能在类似的耐药性形成或传播中起着至关重要的作用。KIM等［77］发现用来自枯草芽孢杆菌的亲脂性探针标记的EVs可以与其他枯草芽孢杆菌细胞融合，DEAN 等［78］发现嗜酸乳杆菌EVs与德氏乳杆菌或大肠杆菌膜融合。在芽孢杆菌属物种中，大约112 个转座酶基因在HGT 中发挥进化作用，10 种前噬菌体参与细菌致病性基因的转移机制［79］。蛋白质组分析显示噬菌体蛋白被包装到EVs 中作为枯草芽孢杆菌的HGT 介质［80］。这些证据提示，在G+细菌中也可能存在通过EVs 进行HGT的机制，并且EVs 中所包含的RNA 也可能发生类似的机制，受体细菌可以暂时使用EVs 传递的RNA 产生相应表型［53］。

3.4 免疫调节 G+-EVs 中携带了脂蛋白和毒素等多种免疫相关分子，这是其诱导宿主免疫应答的前提。金黄色葡萄球菌EVs中含有诱导人类T 细胞活化的超抗原肠毒素SeQ、脂肪酶、免疫逃避蛋白SbI、毒素（如PSMs、LukSF-PV 和LukAB）、降解β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺酶以及能够促进组织侵袭的葡萄球菌蛋白酶A［11，39，45-46，81］。同样，单核细胞增生李斯特菌EVs含有可协助该菌从宿主液泡中逃逸的毒素LLO［14，82］。在炭疽芽孢杆菌中，炭疽毒素致死因子（LF）、水肿因子（EF）和保护性抗原（PA）等存在于EVs，但未在培养上清中发现［40，83］。与之类似的是肺炎链球菌胞质孔形成毒素仅能通过EVs分泌在宿主细胞中释放［47］，这些证据更加证明了EVs 在致病菌毒力组成中的重要性。更有证据表明，与某些分泌的可溶性毒素相比，在EVs 中携带同种毒素后可能对疾病发展的影响更大，特应性皮炎的特征为角质细胞坏死引发的慢性皮肤炎症，导致皮肤屏障功能丧失，HONG 等［84］发现可溶性的金黄色葡萄球菌α 毒素或携带α 毒素的EVs 均诱导角质细胞死亡，但只有EVs 存在才会引起小鼠真皮中角质细胞坏死和嗜酸性粒细胞浸润，这是特应性皮炎特有的过程。这种现象的潜在原因可能为：毒素在EVs 中被富集，并且可以进行更远距离的传递而不会被稀释或被宿主免疫系统清除，可以保证毒素以更高的浓度传递；另一种可能是这两种情况下，毒素与宿主细胞的作用方式可能会存在差异，可溶性毒素只能从外部攻击宿主细胞，而与EVs 相关的毒素可以直接进入受体细胞中，破坏宿主细胞器，并从内部攻击宿主细胞膜［53］。目前G+-EVs 进入宿主细胞的方式有3 种被广泛证实，分别是动力蛋白依赖性内吞作用、网格蛋白依赖性内吞作用以及膜融合，鉴于G--EVs已被发现具有多种内化方式，G+-EVs的内化方式则需要更多的证据进行补充论证［11，13，85-87］。

携带多种毒力因子的G+-EVs 可刺激宿主细胞产生大量细胞因子。Filifactor alocis是一种革兰氏阳性牙周病原菌，其产生的EVs 可促进THP-1 细胞中CCL1、CCL2、MIP-1、ICAM-1、IL-6 及IL-8 等多种细胞因子的产生，并且以TLR2 依赖性方式抑制成骨，参与牙周炎相关骨丢失的发病过程［88-89］。肺炎链球菌EVs在人单核细胞衍生的树突状细胞中以独立于肺炎球菌溶血素的方式诱导IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α 的产生［47，90］。宿主细胞炎症因子的释放与细胞模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）息息相关，G+-EVs 含有大量TLR2 配体，如脂磷壁酸、肽聚糖和脂蛋白，可以与细菌一起通过TLR2 发挥固有免疫调节作用［91-92］。产气荚膜梭菌EVs 通过TLR2 信号通路诱导炎症细胞因子IL-6 的释放［93］。金黄色葡萄球菌EVs 通过TLR2 信号通路增强炎症介质的释放，这种作用主要由EVs 中的脂蛋白所诱导［11，85，94］。WANG 等［11］发现金黄色葡萄球菌EVs 膜内的脂蛋白刺激TLR2，导致NF-κB 激活，大量合成pro-IL-1β 和pro-IL-18，同时EVs 相关的成孔毒素如LukAB 和α-毒素通过K+外流激活NLRP3炎症小体，导 致caspase-1 激 活 并 释 放 活 性IL-1β 和IL-18。TLR2 依赖性激活途径似乎是G+-EVs 促炎作用中的重要信号级联反应，但其他受体信号途径可能也参与其中。BITTO 等［56］的研究结果确定，金黄色葡萄球菌EVs中包含多种微生物相关分子模式（microbeassociated molecular patterns，MAMPs），包括DNA、RNA 和肽聚糖，能够激活细胞模式识别受体TLR2、TLR7、TLR8、TLR9 以及NOD2，并促进上皮细胞释放细胞因子和趋化因子。除促炎反应外，一些益生菌如副干酪乳杆菌所产生的EVs降低了LPS诱导的促炎因子IL-1α、IL-1β、及TNF-α 等细胞因子的表达，并增加了HT29 细胞中抑炎因子IL-10 和TGF-β的表达，来自其他乳酸杆菌物种的EVs 也已被证明可以抑制外周血单核细胞的促炎因子分泌［95-96］。更有趣的是，口服副干酪乳杆菌EVs 通过维持结肠长度和降低疾病活动指数（DAI）来预防葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎，这也提示了益生菌来源的EVs 具有防治疾病的相关潜力［95］。

4 G+-EVs的潜在应用

EVs 携带多种毒力因子，能够有效刺激宿主先天性和适应性免疫系统，并且EVs 本身不可复制增殖，因此其具有比减毒疫苗更安全的优势［22］。LEE等［97］纯化了马链球菌株的EVs，并将其作为感染马链球菌小鼠的候选疫苗进行了免疫评估。他们通过比较蛋白质组学和反向疫苗学的手段发现EVs中富含32种具有疫苗潜力的分子，与用热灭活细菌免疫的小鼠相比，腹膜内注射马链球菌EVs 的小鼠被感染后的存活率更高，表明马链球菌衍生的EVs 可以作为针对马链球菌感染的候选疫苗。除此之外，通过对供体细胞进行基因工程改造，可以进一步提高EVs 的安全性、免疫原性和产量。WANG 等［32］通过基因工程手段，得到可将毒素HlaH35L和LukE 大量包装至EVs 的金黄色葡萄球菌突变体，突变体分泌的EVs 在小鼠中具有免疫原性，诱发溶细胞素中和抗体并为败血症小鼠提供了有效的保护，可作为潜在的疫苗预防治疗金黄色葡萄球菌引发的相关疾病。目前G-菌相关研究中已有基于EVs 的疫苗获得批准，这也暗示了G+-EVs 作为疫苗候选者的巨大潜力［22］。

除此之外，益生菌来源的EVs具有抑菌、抑制炎症以及改善胃肠道功能的作用，可以开发基于益生菌EVs 的药剂，用于一些炎症性疾病的治疗［95-96］。罗伊氏乳杆菌产生的EVs 在治疗婴儿肠绞痛、腹泻和便秘方面具有潜在应用［98］。HU 等［42］鉴定出罗伊氏乳杆菌产生的EVs（LrEVs）携带葡萄糖基转移酶和丝氨酸蛋白酶等被证明有益的分子，进一步研究发现LrEVs 通过抑制NF-κB 活性抑制了LPS 诱导的TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表达，并增强了鸡巨噬细胞中IL-10和TGF-β 的表达，体内实验证明LrEVs 在改善肉鸡生长性能、降低死亡率、减少肠道损伤及维持肠道免疫稳态等方面发挥重要功效。同样弗氏丙酸杆菌和长双歧杆菌来源的EVs也具有类似的效果，弗氏丙酸杆菌来源的EVs 也可通过调节NF-κB途径减轻宿主细胞的炎症，长双歧杆菌来源的EVs含有黏蛋白可以促进益生菌在胃肠道的定植［99-100］。除此之外，植物乳杆菌来源的EVs 对腐败希瓦氏菌的生长有良好的抑制效果，并且显著降低金枪鱼鱼肉中总挥发性基氮（TVBN）、过氧化值（PV）及丙二醛（MDA）的水平，可以作为一种抗菌剂用来延长金枪鱼的保质期［101］。各种益生菌分泌的EVs 携带多种活性物质，在新型药剂开发中具有良好前景。

EVs 周围的脂质膜为内部活性分子提供保护，使内容物免受核酸酶和蛋白酶等降解，具有作为药物运输载体的潜能。RUBIO 等［102］使用体外肠上皮细胞模型研究枯草芽孢杆菌EVs 的转胞吞过程，证明EVs 可以跨胃肠上皮运输，这种机制使EVs 能够到达血液以进一步输送到肠外组织和器官，这也证明将EVs作为药物递送载体用于临床治疗具有实际意义。通过基因工程等手段将药物包装在EVs 中，利用供体细胞的抗原可以将药物靶向传递至受体细胞发挥作用［21］。紫罗兰素（violacein）是一种对G+菌有良好抑菌效果的抗生素，但由于其疏水性质导致其无法自由扩散至靶细胞中。G-紫色色杆菌将紫罗兰素包装至EVs 中，这使紫罗兰素在水中的溶解度提高了1 740倍，携带紫罗兰素的EVs对金黄色葡萄球菌表现出强烈的杀伤效果，这说明以EVs 为载体，将紫罗兰素等疏水性药物运输到靶细胞是一种高效的药物传递方式［103］。这也可以间接说明G+-EVs具有充当药物载体的潜力。

5 展望

综上所述，G+-EVs 携带蛋白质、核酸和脂质等多种物质，在生物膜形成、耐药性、HGT 以及致病菌感染过程中均扮演了重要角色（图1）。然而细菌EVs 的相关研究目前仍然比较集中在G--EVs，具有厚细胞壁的G+菌产生的EVs 相关研究仍然很少，是一个新兴的研究领域。EVs的发现为G+菌将生物活性成分释放到细胞外环境提供了一种新机制，也为进一步探索细菌的生理机制和致病机制提供了新思路。尽管近年来研究有所进展，但G+-EVs 的许多方面仍然不清楚，如G+-EVs 的产生和分泌过程，特定分子在EVs 包装富集的机制，这些都需要大量的研究去探索。使用基因工程和蛋白质组学等技术手段研究G+-EVs，进一步拓宽对G+-EVs 的理解，将有助于新型疫苗或药物的开发。