前列腺癌转基因动物模型研究进展

钟 倩,吴洪瀚,吴恒鹏,陈 伟,方 琴,瓦庆德

(遵义医科大学第二附属医院,贵州 遵义 563000)

前列腺癌是威胁男性健康的常见疾病,研究前列腺癌的发病、侵袭及转移机制等生物学特性具有重要临床意义[1]。前列腺癌的发病与基因异常变化密切相关,但它们在前列腺癌发生及发展中的作用机制尚不明确[2-3]。随着对肿瘤发病机制的深入研究和转基因技术的不断发展,前列腺癌转基因动物模型的研究取得了重要进展,该动物模型通过控制目的基因的表达影响前列腺癌疾病特征,为前列腺癌的发生、发展规律和防治研究提供了重要的平台。

20世纪60年代,人们开始尝试以大鼠建立动物模型研究前列腺癌,但由于该模型很少显示转移灶,在研究中的应用有限[4-5]。一个理想的前列腺癌转基因动物模型应该在不干扰免疫系统的基础上,保留与肿瘤发生相关的遗传和表观遗传学变化,且拥有较短的成瘤期和较高的肿瘤外显率,从而为前列腺癌的临床评估与治疗提供更全面、更准确的参考依据[6]。目前虽然没有一个模型可以独立满足所有标准,但各类模型相互关联形成的多元化信息网络有助于我们开发出更先进的模型。

1 常用转基因模型

既往研究[7-8]表明,抑癌基因p53和rb突变(缺失、失活等)会导致雄激素抵抗性前列腺癌,而猴病毒40(SV40)产生的抗原(T、t)正好可以阻断rb和p53的信号通路,并在小鼠的前列腺上皮特异性表达,进一步诱导小鼠发生前列腺癌。当前利用不同来源的启动子与SV40大T、小t抗原相结合构建了一系列转基因动物模型,最常用的启动子有大鼠PB基因(probasin)、前列腺分泌蛋白94基因(PSP94)、大鼠前列腺类固醇结合蛋白基因[C3(1)]、小鼠α-防御素-2基因(Cryptdin-2)、胎儿Gγ-球蛋白基因(Gγ-globin)等[9]。

1.1 TRAMP转基因模型 TRAMP模型[PB(-426/+28)-SV40 Large T/small t]具有广泛转移的特性,是目前最符合前列腺癌临床病理特征的模型[10]。TRAMP模型利用转基因技术将雄激素依赖性及前列腺组织特异性蛋白rPB导入小鼠受精卵中,通过PB的启动子片段调控SV40大T、小t抗原的表达,进而诱导小鼠前列腺癌发生与发展[11]。TRAMP模型中可观察到前列腺从上皮增生到侵袭性腺癌再到全身多处广泛转移的进行性发展过程[12]。TRAMP小鼠8周龄时可在前列腺背侧叶检测到丰富的SV40大T抗原标记;在10周龄左右时,在前列腺背外侧叶出现低级别上皮内瘤变,并逐渐进展为高级别上皮内瘤变;在12周龄时,开始出现前列腺癌远处转移,并在28周龄时全部发展为转移性前列腺癌,成瘤率为100%[13]。其中,大多数肿瘤发生于前列腺背侧叶,并伴有腹盆淋巴结、肺、肝及皮下转移,其中腹盆腔淋巴结转移率为60%,肺脏转移率为30%,肝脏及皮下组织转移率各为10%[14]。与自发和诱导模型相比,TRAMP模型可控性更佳,包含了小鼠前列腺癌从激素敏感性上皮内瘤变到非激素依赖浸润性癌以及转移性癌的全过程,并提高了成瘤率(100%发病率)。因此,该模型多用于前列腺癌特定发病过程及其转移特性的研究[12,15]。

1.2 LADY转基因模型 LADY模型[PB(-11.5/+28)-SV40 Large T]应用大鼠PB启动子中包含额外雄激素和生长因子反应序列的长片段(-11.5/+28),携带SV40并于小鼠前列腺特异性表达其大T抗原[16-17]。在该模型已建立的7个不同转基因表达水平和不同表型的品系中,仅12T-10品系存在转移性病变,并可进展为晚期腺癌[17]。该品系的独特之处在于将转基因序列插入小鼠X染色体后,可观察到前列腺组织从具有神经内分泌特征的上皮内瘤变(PIN)发展为侵袭性神经内分泌癌[16]。在该模型中,小鼠6月龄时可在一个部位发现转移灶,9～10月龄时可在多个部位发现转移灶,但只有14%的小鼠模型发生了骨转移,侵袭性前列腺癌通常转移至淋巴结、肝、肺、脾、肾等部位,偶见骨转移[6]。LADY模型选择性表达大T抗原并剔除小t抗原的方式,使其特异性具备神经内分泌特征。然而,该模型中前列腺癌细胞增殖能力受限,不具备TRAMP转基因模型的强侵袭性[18]。因此,该模型常用于探讨前列腺神经内分泌癌的发生与发展机制。

1.3 C3(1)转基因模型 大鼠前列腺类固醇结合蛋白构建的C3(1)-SV40Large T/small t小鼠模型由C3(1)启动子驱动SV40大T抗原的表达,是第一个前列腺癌转基因动物模型[6]。然而,C3(1)基因的调节区域 5’端缺乏重要的调控元件,无法将其表达局限于前列腺组织中,因此在尿道、膀胱和唾液腺中也可观察到转基因表达[19]。此外,有学者利用大鼠C3(1)基因5’端和第一外显子中的激素反应元件构建的转基因动物模型证实C3(1)基因的表达具有性激素依赖性[20-21]。在该模型中,所有雌性小鼠在6个月大的时候都会患上乳腺癌;雄性小鼠8月龄左右时即出现前列腺增生,最终进展为上皮内瘤变甚至是前列腺癌,偶尔还会转移到其他组织,如肺和骨[22]。该模型的非靶向性及性激素依赖型,致使该模型中可能存在一种组织含多种肿瘤特征或者肿瘤在前列腺以外器官中表达的情况。但是,该转基因模型中前列腺癌发展过程是高度可预测的,并且发生的时间相对较长,可用于研究激素反应元件及前列腺从正常组织到癌变的多阶段进展过程[23]。

1.4 Cryptdin-2转基因模型 Cryptdin-2/SV40 Large T模型利用了小鼠Cryptdin-2基因-6500到+34位核苷酸,引导FVb/N小鼠前列腺各神经内分泌细胞亚群表达SV40大T抗原,使其发展为神经内分泌型前列腺癌[24]。该模型最初建立后主要用于研究小肠Paneth细胞的作用。然而,在该品系小鼠5～7月龄时,雄性转基因小鼠均死于前列腺肿瘤。通过进一步研究,人们注意到SV40大T抗原在导致成熟Paneth细胞丢失的同时,会在前列腺中定向表达。CR2-TAG小鼠在8周龄时,即TAG表达开始后1周,发生前列腺上皮内瘤变。2～4周后出现侵袭期,16周内出现淋巴结、肝、肺、脑和骨转移[25]。该模型存在两个显著优势:其一,转基因动物模型疾病特征的表达并不依赖于雄激素,因此雌性转基因小鼠生长发育与非转基因雌性(或雄性)同窝动物相同;其二,该模型在复刻人类前列腺癌多种组织病理学特征的同时,避免了神经内分泌来源的前列腺癌进化中对雄激素的依赖性[24,26]。与TRAMP模型相比,该模型成瘤周期更短,并为临床诊断前列腺癌神经内分泌分化提供了新的生物标志物。

1.5 Gγ-globin转基因模型 既往研究[27]发现,在胎儿Gγ-globin 启动子与SV40大T抗原病毒癌基因相连(Gγ/T-15)的转基因小鼠模型中,本该表达于胚胎红系组织中的基因结构,可在前列腺中表达并进展为前列腺癌。而大T抗原仅表达于成人前列腺,胎儿及新生儿前列腺均不能检测到该抗原,这表明前列腺癌的进展与雄激素密切相关。当对表达前列腺癌疾病特征的小鼠进行去势处理后,并没有阻止前列腺癌的发展,这证明该前列腺癌是雄激素非依赖性的,因此Gγ/T-15转基因品系可作为一种高侵袭性雄激素非依赖性转移性前列腺癌模型。此外,有75%的半合子和100%的纯合子转基因雄鼠发生前列腺癌,提示了T抗原的剂量效应,因此该模型与神经内分泌的关系还有待进一步探讨[28]。该模型无需使用免疫缺陷小鼠,能较为准确地模仿侵袭性和转移性人类前列腺癌进展过程,为缺乏特定靶向治疗的非雄激素依赖性转移性前列腺癌提供了特征性的生物标记物及潜在治疗方法。然而,胎儿珠蛋白启动子并非前列腺特异性的,因此其他器官也有肿瘤病变,因此该模型具有一定的局限性[27]。

1.6 PSP-KIMAP转基因模型 该模型利用PSP94基因启动子/增强子靶向调控小鼠前列腺并特异性地表达SV40大T/小t抗原[29]。前列腺上皮细胞分泌的PSP94能在人和小鼠的前列腺中特异性表达,故可用于早期诊断和治疗前列腺癌[30]。PSP-KIMAP小鼠模型复现了部分人类前列腺癌的特征,在10周龄左右可观察到前列腺上皮内瘤变,而在24周时进展为侵袭性腺癌并伴有淋巴结、肺和肝脏等远处转移[24]。与TRAMP模型和LADY模型相比,该模型更能模拟人体前列腺癌发生与发展过程,其具备更稳定的表型与更精确的前列腺组织靶向性[16]。目前PSP-KIMAP转基因模型品系研究尚不完善,但其在复刻前列腺癌方面是值得肯定的,可作为其他模型的补充,应用前景广阔。

2 转基因模型在前列腺癌研究中的应用

近年来转基因鼠模型广泛应用于肿瘤发病机制的研究、肿瘤药物的筛选及肿瘤的基因治疗。Connelly等[31]通过LADY转基因模型测试Foxy2是否激活雄激素受体(AR)反应启动子并促进T抗原的表达。Elisia等[32]运用C3(1)-SV40 大T/小t转基因模型研究癌变状态下低碳水化合物(CHO)饮食对机体血糖、胰岛素、IL-6、TNF-α等指标的影响,以反映前列腺癌的葡萄糖依赖性差异。Varghese等[33]通过SV40 T抗原驱动的TRAMP前列腺癌模型发现,自然杀伤T细胞(iNKT细胞)表达的一种半不变量T细胞受体可与某些糖脂(如α-半乳糖基神经酰胺)结合,从而分泌大量干扰素γ以增强抗肿瘤药物粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的抗肿瘤作用,为进一步开发利用iNKT细胞激活的治疗疫苗提供思路,为肿瘤的临床治疗打下了坚实的基础。

3 小结与展望

以上各转基因模型都是依赖于SV40表达的大T、小t抗原联合不同的启动子建立起来的。目前已知晓大T、小t抗原都与广泛的细胞通路相互作用并影响其功能。大T抗原的插入可以消除抑癌基因p53和rb的功能,可能打破细胞正常生长的稳态,并可能进一步导致遗传的不稳定性。同时,小t抗原的表达通过阻断蛋白质磷酸酶-2A(PP2A)的功能性表达,从而维持促癌蛋白激酶通路的持续活性,促进肿瘤细胞的生长和存活。这些转基因动物模型的临床特征会因肿瘤发病时间不同而受到干扰,可能导致肿瘤生长潜伏期较长,或者骨转移倾向较低。此外,该模型中的致癌过程是在病毒蛋白的帮助下启动的,但病毒蛋白与人类前列腺癌发展的相关性尚不清楚。

参与调控前列腺癌进展的因素多且复杂,而转基因动物模型能再现前列腺癌的各个阶段,对于研究前列腺癌的病因、早期预防和潜在治疗方法具有重大意义。但转基因模型费用高、周期长,裸鼠难形成大体积瘤体,并且难以控制肿瘤的异质性带来的基因表达偏差,因此前列腺癌转基因动物模型仍有待深入研究。未来可以尝试构建成瘤期较短、针对肿瘤的异质性且能综合模拟体内前列腺癌发生与发展及转移的转基因动物模型,为前列腺癌的机制研究、药物研究和防治方法提供更理想的研究模型。