SPME-GC-MS 联用法测定鲤和草鱼肌肉挥发性腥味物质的条件优化

曲乐天，夏腾，张晶晶，周鑫蔚，许建和，丁祝进，陈香凝，程汉良

（江苏海洋大学海洋科学与水产学院，江苏 连云港 222005）

鲤（Cyprinus carpio）和草鱼（Ctenopharyngodon idella）是我国重要的淡水养殖鱼类。2019 年我国鲤养殖产量为2 885 284 t，比2018 年减少了2.6%，比2017 年减少了4%；2019 年草鱼养殖产量为5 533 083 t，比上年增加了0.52%，比2017 年增加了3.43%[1]。大部分消费者认为鲤的土腥味较草鱼更重，这可能是导致鲤和草鱼产量变化的潜在因素之一，因此有必要对比分析鲤和草鱼肌肉腥味物质的差异。

目前萃取水产品挥发性腥味物质的方法主要有五种，分别是吹扫捕集法、固相微萃取法、有机溶剂提取法、水蒸气蒸馏法，及同时蒸馏萃取法[2]。由于有机溶剂萃取法在实验结束后产生的有机废液会对环境造成污染，而蒸馏萃取法在萃取过程中挥发性成分会损失，所以目前主流的萃取方法是固相微萃取法和吹扫补集法[3]。尤其是固相微萃取方法，其操作简单、灵敏度很高、所需样品量少，已被广泛用于食品、医药检测[4]。

本文通过筛选萃取纤维、氯化钠添加量、萃取温度、萃取时间、解析时间等固相微萃取条件，旨在优化SPME-GC-MS 联用法测定淡水鱼肉挥发性气味的鉴定方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

鲤和草鱼均购自江苏省连云港市赣榆区欢墩鱼场，体质量约为（128.22±1.25）g。

1.2 实验仪器和萃取纤维

实验仪器：岛津GC-MS（QP2010 SE）、色谱柱为Agilent DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 mm）；固相微萃取加热和磁力搅拌装置。

萃取纤维为PDMS/DVB/CAR 50/30 μm，不同萃取纤维的固相涂层和厚度对挥发性成分的萃取吸附能力不同。PDMS/DVB/CAR 50/30 μm 萃取纤维是由DVB（二乙烯基苯）、CAR（Carboxen）、PDMS（聚二甲基硅氧烷）3 种涂层复合而成，相较单层萃取纤维可以萃取到更多的挥发性成分。且这种萃取纤维较长，可以富集更多成分。

1.3 实验方法

1.3.1 GC-MS 参数:

气相条件：升温程序：初始温度40℃，保持5 min，以4℃/min 升至120℃，保持1 min，以13℃/min 升至250℃，保持5 min；进样口温度250℃；载气（He）流量：1.0 mL/min；不分流进样。

质谱条件：电子轰击离子源，离子源温度230℃，接口温度250℃；电子能量70 eV；质谱检测器选择Scan 检测方式。

1.3.2 萃取纤维的老化

将PDMS/DVB/CAR 萃取纤维插入气相色谱进样口进行270℃/0.5h 的老化，直至无杂峰出现。

1.3.3 样品处理

将鱼击晕后取背部肌肉绞碎作为实验材料。准确称取3 g 鱼肉于15 mL 顶空瓶中，加入不同浓度NaCl 溶液，加入搅拌子，并用聚四氟乙烯隔垫密封。根据预实验将本实验温度设置为40℃、50℃、60℃，将萃取时间设置为30 min、40 min、50 min。萃取结束后将萃取纤维插入GC 进样口进行解析。

1.3.4 样品处理

采用SPSS statistics analysis 23.0 数据统计软件包对数据进行统计分析，实验数据采用平均值±标准差表示，显著水平P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 固相微萃取条件的优化

2.1.1 萃取温度和萃取时间对萃取效果的影响

温度升高会加快挥发性分析物的分子运动，有利于挥发性分析物在基质中扩散，能够有效缩短平衡所需要的时间；但温度过高会使纤维涂层和基质中分析物的分配系数降低，分析物在纤维上的吸附量将减少，萃取纤维吸附分析组分的能力将会降低[5-7]。温度太低会导致挥发不完全，也会影响萃取效果。

萃取时间由待分析样品的分配系数和样品基质、样品体积以及分子扩散速率、萃取涂层厚度等因素决定[8]。在萃取过程中存在吸附-解吸-吸附的平衡问题，因此并不是吸附时间越长越好，且实验时间越长，顶空瓶中的水蒸气浓度也会增加，而水蒸气会降低萃取纤维对挥发物的吸附。

实验样品量为3.00 g，NaCl 浓度为0.36 g/mL，解析时间为5 min，不同吸附温度和吸附时间对萃取效果的影响见图1。结果表明：萃取时间为30 min，60℃的总峰面积显著高于40℃、50℃（P＜0.05）。萃取时间为40 min，60℃的总峰面积依然显著高于40℃、50℃（P＜0.05），且此时可发现，各温度的总峰面积显著高于30 min 时各温度的总峰面积（P＜0.05）。萃取时间为50 min，50℃、60℃的总峰面积显著低于40 min 时的总峰面积（P＜0.05）。因此可确定，在上述实验条件下，最佳萃取温度为60℃，最佳萃取时间为40 min。

2.1.2 离子浓度对萃取效果的影响

在样品进行萃取之前添加NaCl 可以降低有机化合物的溶解度，提高分配系数，有利于萃取纤维对待分析化合物的吸附。在固定样品量为3.00 g，萃取时间为40 min，萃取温度为60℃，解析时间为5 min 的条件下，分别添加不同浓度NaCl（0 g/mL、0.18 g/mL、0.27 g/mL、0.36 g/mL）3 mL，研究NaCl 添加量对总峰面积的影响。随着NaCl 浓度不断升高，总峰面积不断升高，在NaCl 浓度为0.36 g/mL 时总峰面积达到最大值，表明萃取效果最好（图2）。

图2 NaCl 添加量对萃取效率的影响Fig.2 Effect of NaCl spiked levels on extraction efficiency

2.1.3 搅拌对萃取结果的影响

搅拌在一定程度上可以加速萃取过程，本实验比较了不搅拌和搅拌对部分挥发性物质萃取效果的影响。在搅拌状态下，主要挥发性物质的峰面积均显著高于不搅拌（P＜0.05），所以搅拌可以明显提升萃取效果（图3）。

2.1.4 解析时间对萃取结果的影响

解析过程是将吸附结束后的萃取纤维插入GC进样口，利用高温热解萃取头上吸附的挥发性化合物，然后通过载气（He）将其送入色谱柱中进行分析，解析时间太短会导致解析不完全，解析时间过长则会减少萃取纤维的使用寿命。本实验在固定样品量为3.00 g，萃取时间40 min，萃取温度60℃，NaCl 浓度为0.36 g/mL 的条件下，将解析时间设定为1 min、3 min、5 min、7 min。结果如图4，在解析时间为5 min 时，总峰面积显著高于1 min、3 min（P＜0.05），当解析时间超过5 min 后，总峰面积略有降低，因此确定在上述实验条件下，最佳解析时间为5 min。

图4 解析时间对萃取效果的影响Fig.4 Effect of desorption time on extraction efficiency

2.2 鲤、草鱼挥发性成分的鉴定与比较分析

采用上述最优萃取条件对鲤和草鱼肌肉中挥发物质进行萃取，将鲤和草鱼肌肉挥发性物质经NIST 谱库对比检索，只选取相似度大于90%的化合物，最终确定鲤和草鱼肌肉中的35 种挥发性成分，并采用峰面积归一化法计算各种化合物相对含量。新鲜鲤肌肉含有5 种醛类化合物（43.32%）、7 种醇类化合物（47.91%）、13 种烷烃（3.96%）、3 种酯（3.40%）、3 种烯烃（0.36%）、3 种酸（0.67%）和1 种酮（0.39%）。新鲜草鱼肌肉中含有5 种醛（33.12%）、7 种醇（51.82%）、10 种烷烃（5.95%）、6 种酯（7.32%）、2 种醚（1.03%）、1 种酸（0.07%）、1 种烯烃（0.06%）和1 种酚（0.63%）（表1）。

表1 鲤、草鱼肌肉挥发性物质组成对比（/%）Tab.1 Comparison of muscle volatile composition in carp and grass carp

3 讨论

研究发现醛类化合物阈值很低，其对鱼肉的气味有重要贡献，它们大多来源于多不饱和脂肪酸的氧化。饱和直链醛通常会产生一些刺激性气味，其中己醛是n-6 不饱和脂肪酸氧化的产物，具有青草味、腥味[9]，壬醛是n-9 不饱和脂肪酸氧化的产物，也具有鱼腥味[10]，目前这类物质已被证明普遍存在于淡水鱼中[11]。本实验结果显示鲤己醛的含量为38.49%，远高于草鱼的24.06%，鲤醛类物质总含量也显著高于草鱼，这表明鲤鱼肉腥味比草鱼肉更重。

有研究指出，脂肪氧化分解或羰基化合物还原会产生饱和醇类，饱和醇类阈值较高，如己醇、庚醇等，对鱼肉风味影响较小[12]。不饱和醇类阈值较低，对鱼肉气味贡献较大[13]，其中1-辛烯-3-醇广泛存在于淡水鱼中，它被证实是ARA 氧化降解的产物，具有类似蘑菇的香味[14]，其阈值仅为1.5ng/g。本实验中鲤组1-辛烯-3-醇的含量为17.44%，低于草鱼组的19.77%，说明草鱼的气味较鲤更好一些。

鱼肉中的烃一般来源于烷氧自由基脂肪酸氧化或者类胡萝卜素分解而成，其阈值较高，对鱼肉风味影响较小[15]，但他们在一定程度上也会提高鱼肉的香味，本实验中草鱼组的烷烃含量高于鲤组，也表明了，草鱼的气味较鲤好一些。

酸类物质是醛类、醇类、酯类的前体物质，一般是由脂肪酸甘油三酯降解而成，其阈值较高，对水产品风味影响不大[16]。酯类物质如邻苯二甲酸二异丁酯等是由酸和醇之间的酯化反应生成，也与微生物发酵和脂肪酸代谢相关。酮类是醛类的同分异构体，可能来源于脂肪酸氧化或氨基酸降解，可能对鱼腥味由一定的增强作用，由于阈值较高，所以对气味特征贡献较低[17]。

结论

采用SPME-GC-MS 技术优化了鲤鱼肉中的挥发性成分检测条件，得到的最佳萃取条件为：在3.00 g 鱼肉中加入3 mL 饱和NaCL 溶液（0.36 g/mL），使用50/30 μm 的PDMS/DVB/CAR 萃取纤维在60℃下搅拌萃取40 min，之后将萃取纤维插入GC 进样口解析5 min。在该条件下对鲤和草鱼肉挥发性物质进行了萃取并比较分析，各得到35 种主要挥发性风味物质。实验结果表明：鲤肌肉挥发性成分中的醛类物质含量高于草鱼，尤其是产生腥味的主要物质-己醛的含量远高于草鱼，醇类中的主要香味物质1-辛烯-3 醇的含量低于草鱼，烷烃的含量也低于草鱼，说明鲤的腥味较草鱼更重一些。