木犀草素通过TLR4/NF-κB途径对哮喘模型幼鼠炎症的影响

刘克新，龚本新，何飞雪，黎胜年，郑 英，雷华凤

1.中国科学院大学深圳医院（光明）东院区儿科，广东 深圳 518000；2.中国科学院大学深圳医院（光明）妇幼保健部，广东 深圳 518000

哮喘是一种常见的气道炎症性疾病，以反复阻塞气道为特征，与黏液分泌过多和气道炎症细胞浸润有关。目前，全球哮喘患者超过3亿多人，且数量逐年上升［1］。目前治疗哮喘的方法主要是使用吸入皮质类固醇、长效β2抑制剂等药物。但目前关于哮喘的治疗过程中，部分治疗的疗效不确定，且因药物的副作用，患者依从性比较差［2］。因此有必要探究新的药物控制哮喘的症状。

Toll 样受体（Toll-like receptors 4，TLR4）是一种模式识别受体，研究报道OVA激活Toll样受体通路及其下游靶点核因子κB 蛋白（Nuclear Factor Kappa-B，NF-κB），引起Th2相关哮喘炎症反应的加重和炎症细胞因子基因表达，NF-κB是一种多细胞转录因子，在调节炎症和免疫反应中也起着重要作用［3］。抑制NF-κB 可以减轻卵清蛋白（OVA）诱导的过敏性哮喘［4］。

木犀草素（Luteolin，LT）以糖苷的形式存在于多种植物中，这些植物以全叶青兰、辣椒、野菊花、金银花、紫苏含量较高，具有镇咳和祛痰作用。据最新研究，呼吸道症状咳嗽、咳痰、喘息，均与气道慢性炎症有关，如支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、慢性咽炎、变应性鼻炎等引起咳嗽、咳痰、喘息，均被认为与局部的炎症浸润有关。炎症的存在使得气道的免疫应答混乱，患者常出现气道反应性增高，治疗的手段首先应该消除气道的慢性炎症浸润。目前常用糖皮质激素消除气道炎症，但糖皮质激素的副作用较多，不宜长期应用。研究表明，LT抑制巨噬细胞磷酸化，抑制转录因子NF-kB的活性，能够抑制脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞产生细胞因子IL-6，TNF-α。后两种细胞因子在炎症机制中扮演非常重要的角色，是反映炎症程度的敏感指标。LT 还能提高IFN-γ，降低特异性IgE，减少嗜酸性粒细胞的浸润。另外，LT 除了抗炎、抗过敏作用以外，还具有抑制PDE、抗SARS、HIV 病毒特性，其原因为抑制SARS 病毒前S 蛋白的活性，从而阻止其进入宿主细胞。LT用于治疗COPD、支气管哮喘、慢性咽炎以及变应性鼻炎等引起的慢性咳嗽。LT是一种具有抗炎作用的天然黄酮类化合物，具有抗炎和自由基清除作用［5］，目前研究发现LT 能减轻过敏性小鼠支气管收缩和气道高反应性调节，但对LT通过TLR4相关途径的哮喘尚无研究。因此，本研究探讨木犀草素是否可以通过抑制TLR4/NF-κB 途径诱导抑制哮喘模型的炎症。

1 实验材料

1.1 实验动物

选择SPF 级SD 雌性幼年小鼠40 只，4 周龄，体重（100±20）g。广东省实验动物中心提供，饲养深圳大学SPF动物房。

1.2 主要试剂和仪器

木犀草素（中国MCE公司）， 卵清蛋白（哈尔滨百杰斯生物公司），大鼠血清IL-2、IL-4 ELISA 试剂盒（南京建成生物工程研究所），RevertAid First Strand Cdna［美国赛默飞世尔科技（中国）有限公司］，PowerUp SYBRTM Green Master MIX［美国赛默飞世尔科技（中国）有限公司］，兔抗大鼠TLR4 抗体（美国abcam 公司），兔抗大鼠NF-κB p65 抗体（美国abcam 公司），兔抗大鼠GAPDH 抗体（美国abcam公司），HRP-羊抗兔IgG抗体（美国abcam公司），超声雾化器（江苏鱼跃医疗设备有限公司）。

2 实验方法

2.1 哮喘造模

将幼年小鼠适应性饲养3 d 之后，除去正常组幼鼠10只，剩余30只幼鼠在第1 d、7 d腹腔注射卵清蛋白和氢氧化铝预混制备的乳化液共1 mL（100 mg 氢氧化铝和1 mg卵清蛋白）。第15 d、16 d、17 d、18 d、19 d分别给予雾化吸入含3% OVA的生理盐水20 min，正常组以及生理盐水代替卵清蛋白进行腹腔注射及雾化吸入。

2.2 药物干预

OVA干预造模小鼠组随机分为3组，分别是哮喘模型组、LT低浓度组、LT高浓度组，每组10只小鼠。LT低浓度组、LT高浓度组均从第1次哮喘激发开始（造模第15 d），每只每天分别予1 mg/kg，2 mg/kg 腹腔注射，以上各组连续给药14 d后，然后把小鼠处死进行实验研究。

2.3 实验标本采集

第30 d，进行幼鼠眼眶取血，静置15 min 后，4 ℃，3 000 r/min，离心10 min，取上层血清，保存于-80 ℃冰箱中；开胸取出左上肺组织，冷冻于液氮中；取出右上肺组织，放入4%多聚甲醛固定。

2.4 小鼠气道高反应检测

采用小鼠无创肺功能仪检测小鼠气道高反应情况，按照肺功能仪检测步骤，使用不同剂量（0 μg /mL、6.25 μg /mL、12.50 μg /mL、25.00 μg /mL、50.00 μg /mL、100.00 μg /mL）乙酰甲胆碱激发后，检测各组小鼠气道高反应。

2.5 血清IL-2、IL-4含量测定

取冻存的血清，采用ELISA 方法检测各组大鼠血清IL-2、IL-4的浓度，具体实验方法根据ELISA试剂盒说明书操作，绘制标准曲线，计算IL-2、L-4浓度。

2.6 肺组织病理切片炎症观察

将右上肺从4%多聚甲醛中取出，进行常规脱水，石蜡包埋，切片，苏木精—伊红染色，封片，显微镜下观察肺组织炎症情况。

2.7 肺组织TLR4、NF-κb pP65的RNA表达

从NCBI库查找大鼠TLR4、NF-κB 基因，根据基因设计TLR4、NF-κB，取每组左上肺组织，放入液氮中充分研磨，按照RNA 提取试剂盒说明书，提取RNA。测量RNA浓度，根据RevertAid First Strand cDNA试剂盒，转录成CDNA；根据PowerUp SYBRTM Green Master MIX 试剂盒操作步骤，上机检测TLR4、NF-κB的RNA表达。

2.8 肺组织TLR4、NF-κB pP65的蛋白表达

取出肺组织，放入液氮中充分研磨，加入生理盐水100 μL及1 μL蛋白酶抑制剂，14 000 r/min，离心后，取上清液，测蛋白浓度，根据蛋白浓度加入1×loading buffer，100 ℃水中煮10 min，取30 μL 每孔上样，进行SDS-PAGE 电泳，转膜后，3%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入兔抗大鼠TLR4 抗体（美国abcam 公司），兔抗小鼠NF-κB pP65 抗体，兔抗大鼠GAPDH 抗体等一抗，4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤5 次，加入HRP-羊抗兔IgG 抗室温孵育2 h，TBST 洗涤5 次，加ECL 发光液，置于仪器中发光显色，imagJ计算灰度值，

2.9 统计学方法

采用SPSS 10.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间采用单因素方差分析的方法进行统计分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 小鼠气道高反应检测

通过大鼠气道高反应检测，模型组在乙酰甲胆碱浓度为50.00 μg /mL、100.00 μg /mL时，气道高反应明显高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01）；LT 低浓度、LT高浓度组在乙酰甲胆碱浓度为50.00 μg/mL、100.00μg/mL时，气道高反应低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 小鼠气道高反应检测 μg/mL

3.2 各组大鼠血清IL-4、IL-2含量

ELISA检测血清IL-4、IL-2浓度，模型组血清IL-4浓度明显高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01），模型组血清IL-2 浓度明显低于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01）；LT低浓度组、LT高浓度组血清IL-4浓度低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），LT低浓度组、LT高浓度组血清IL-2 浓度高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠血清IL-4、IL-2含量（±s） pg/mL

表2 各组大鼠血清IL-4、IL-2含量（±s） pg/mL

a 表示与模型组比较，P＜0.01；b 表示与模型组比较，P＜0.05。

组别正常组（n=10）模型组（n=10）LT低浓度组（n=10）LT高浓度组（n=10）IL-4 54±2.5 127±4.5a 80±3.4b 67±2.1b IL-2 154±6.3 56±5.6b 134±3.4b 123±3.5b

3.3 各组肺组织炎症病理观察情况

正常组：小鼠肺组织支气管内及周围无明显炎性细胞浸润，组织黏膜未见充血水肿，肺泡间隔狭窄，肺泡腔清亮宽敞。模型组：支气管壁、管腔内及血管、支气管周围有炎性细胞浸润，支气管黏膜水肿、增厚、上皮脱落、微血管渗漏、管腔内分泌物增多，基层细胞增生、平滑肌增厚，组织黏膜充血水肿，肺泡间隔变宽，肺泡腔变狭窄。LT低浓度组：肺组织嗜酸性粒细胞及其他炎性细胞浸润减少，管壁和平滑肌厚度减少，组织充血水肿现象减轻，肺泡腔变宽，肺泡间隔变窄。LT高浓度组：大鼠肺组织支气管内及周围炎性细胞浸润明显减少，管壁完整，组织黏膜充血水肿减少，肺泡间隔狭窄，肺泡腔清亮宽敞。

3.4 肺组织TLR4、NF-KB的mRNA表达

PCR 检测肺组织TLR4、NF-κB 的RNA 表达，模型组TLR4、NF-κB 的RNA 表达明显高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01）；LT 低浓度组、LT 高浓度组TLR4、NF-κB 的RNA 表达表达低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1。

图1 肺组织TLR4、NF-KB的mRNA表达

3.5 肺组织TLR4、NF-κB pP65的蛋白表达

WB 检测肺组织TLR4、NF-κB pP65 的蛋白表达，模型组TLR4、NF-κB pP65蛋白表达明显高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；LT 低浓度组、LT 高浓度组TLR4、NF-κB pP65 蛋白表达低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 肺组织TLR4、NF-κB pP65的蛋白的表达

4 结论

哮喘是儿童常见的慢性呼吸道炎症性疾病，其特征是气道高反应性、间歇性气道阻塞和肺功能降低，其主要是以Th2 细胞为主介导的自身免疫性疾病［6］。研究发现，OVA 能明显诱导小鼠哮喘的气道高反应，而LT 能有效改善OVA 诱导哮喘模型的气道高反应。IL-4 主要由活化的Th2细胞产生，能增强B 细胞作用，促进IgE 介导的免疫应答，诱导气道的炎症［7］。IL-2 主要由活化的Th1细胞产生的促进T 细胞增殖、分化的细胞因子，抑制Th2 的表达，减少促炎细胞因子和趋化因子的表达［8］。研究者发现OVA 能诱导小鼠哮喘模型IL-4 的产生、抑制IL-2 的形成，而LT能抑制细胞因子IL-4 的表达，而促进IL-2 的表达，说明其可能够调节哮喘模型Th1/Th2平衡，而LT组肺部病理炎症明显改善，LT具有抑制哮喘炎症的作用。

哮喘是一种以气道炎症为特征的过敏性疾病，暴露的过敏原会引发与Th2反应相关的气道炎症，诱导嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞浸润，从而促进各种炎症介质和细胞因子的释放［9］。TLR4 是一种重要的免疫模式识别受体，调控先天性和适应性免疫反应，促进细胞因子的合成和释放，促进炎症反应的产生［10］。研究发现，脂多糖加重肥大细胞过敏性气道炎症是通过激活肥大细胞中的TLR4 介导的，而TLR4 又反过来刺激Th2 反应［10］。TLR4/NF-κB下游通路能调节脂多糖刺激的肥大细胞产生Th2细胞因子［11］。TLR4信号启动NF-κB的激活，诱导基因转录和多种炎症介质的表达。NF-κB是参与所有类型细胞过程的必需转录因子复合物，包括细胞代谢、趋化性等，NF-κB在调节免疫应答以及细胞增殖和分化方面也有重要作用［12］。因此，TLR4/NF-κB信号通路对哮喘的免疫调节过程至关重要，是哮喘的重要病理机制。NF-κB pP65 是NF-κB 家族中的主要活性蛋白。本研究发现OVA 能诱导哮喘哮喘TLR4/NF-κB 相关蛋白的表达，与文献报道一致。 本研究发现木犀草素治疗组能抑制TLR4、NF-κBpP65 蛋白的表达，说明木犀草素可能通过TLR4/NF-κB途径抑制哮喘的炎症反应。

综上所述，LT 对哮喘具有抗炎作用，很可能与调控TLR4/NF-κB途径有关。