糖基化大豆抗原蛋白的致敏性及其对肠道健康的影响

■殷海成 杨智翔 陈 莹 马源青 李岳燕

（河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450001）

食物的致敏“元凶”是抗原蛋白的抗原决定簇，也称抗原表位[1]。抗原表位的组成、结构及空间构象决定抗原蛋白的致敏性[2]。大豆是公认的过敏原，其高致敏性严重影响婴幼儿或幼龄动物（仔猪[3]、犊牛[4]等）的食用安全，其中大豆11S 球蛋白（主成分是大豆球蛋白，glycinin）和大豆7S 球蛋白（主成分是β-伴大豆球蛋白，β-conglycinin）是含量最多、致敏性最强的抗原蛋白[5]。近年，随着人们对食品安全要求的提高，大豆蛋白过敏问题成为世界性的公认问题，而如何消除抗原蛋白致敏性成为普遍关注的热点。

Glycinin 是分子量为300～370 ku 的六聚体蛋白，由酸性亚基A（A1a、A1b、A2、A3、A4、A5）和碱性亚基B（B1a、B1b、B2、B3、B4）通过二硫键和疏水键结合而成[6]。β-conglycinin是由3亚基（α′、α、β）通过氢键与疏水作用形成的分子量为140～180 ku的糖蛋白[含糖约5%，其糖基与天冬氨酸（Asp）的N-端相结合][7]。由于α′、α、β亚基均含糖基，因此其空间结构的柔性、亲水性均较强[8]；而glycinin 含二硫键较多，其刚性结构使亲水性变弱[9]。截止到目前，大豆抗原蛋白的结构、抗营养性[10]、致敏机制[11]、灭活技术[12]、美拉德反应（Maillard reaction）[13]等都有很多研究。其中美拉德反应是指含游离氨基的蛋白质/肽/氨基酸等与含羰基的还原糖/醛/酮之间进行的脱水缩合反应，是食品加工和储存中普遍发生的非酶褐变反应，对食品的色、香、味等形成具有至关重要的作用[14]。蛋白质糖基化的本质是美拉德反应，不仅能改善蛋白质的功能特性[15]，还赋予了糖基化产物易消化、低致敏性、抗氧化、抑菌以及抗炎等潜在的促进肠道健康的特性[16]，引起普遍关注。文章基于现有的大豆抗原蛋白糖基化研究现状，综述了糖基化大豆主要抗原蛋白的致敏性及对肠道健康的影响，为糖基化改性抗原蛋白及应用提供参考。

1 美拉德反应与大豆抗原蛋白糖基化

1.1 美拉德反应过程

美拉德反应是1912 年由法国科学家Louis Camille Maillard 提出，1953 年被John 等命名，又被称为非酶褐变（Non-enzymatic browning）反应[17]。美拉德反应是复杂的化学反应过程，普遍发生在食品加热或储存中[18]，至今其反应途径和产物尚未完全清楚。依据现有研究成果将其反应过程分为初期、中期和末期3个阶段。初期阶段是蛋白质的氨基与糖分子的醛基进行缩合反应，生成糖基化产物（亚胺衍生物——Schiff 碱）。由于Schiff 碱性质不稳定，随即环化形成取代醛糖基胺并在酸催化下经Amadori 重排和Heys重排生成稳定的1-氨基-1-脱氧-2-酮糖或2-氨基-2-脱氧-1-酮糖的蛋白质缀合物[19]。中期阶段是(Amadori重排和Heys重排生成中间产物阶段，受反应体系pH的影响。在pH≤7.0时，主要发生1，2-烯醇化反应产生糠醛或羟甲基糠醛；而当pH＞7.0时，主要发生2，3-烯醇化反应产生还原酮和裂解物[20]。末期阶段是反应生成物中各活性中间体发生脱水、成环、异构、重排等一系列反应，生成褐色和香气味物质阶段[21]。值得注意，该反应也导致部分氨基酸损失或生成丙烯酰胺等物质而造成不安全问题[22]。

1.2 大豆抗原蛋白糖基化及方法

蛋白质糖基化通常被认为是美拉德反应的初期阶段。大豆抗原蛋白中的氨基尤其是赖氨酸的ε-氨基通过共价键与糖中的还原性碳基发生脱水缩合反应，生成N-糖基胺。N-糖基胺不稳定，易发生不可逆的Amadori 重排和Heys 重排，生成稳定的1-氨基-1-脱氧-2-酮糖或2-氨基-2-脱氧-1-酮糖的蛋白质缀合物[19]。这个糖基化反应不改变大豆抗原蛋白的一级结构，并保持蛋白质原有的功能属性，且在多糖的作用下改善蛋白质的功能特性。

目前，蛋白质糖基化主要采用干热法和湿热法。干热法糖基化由日本的Kato 等[23]在1988 年首先提出。是将糖与蛋白质按一定的比例溶解在已确认pH的缓冲液（多用磷酸盐）中，均匀溶解后制备冷冻干燥样本，样本在50～60 ℃和65%～79%环境湿度[用饱和碘化钾（KI）或溴化钾（KBr）维持]下进行美拉德反应，降温可抑制该反应。干热法糖基化大豆抗原蛋白其致敏性显著降低，但反应的时间相对较长，同时反应过程中控制反应条件较难[24]。湿热法糖基化是蛋白质与单糖或多糖溶解在溶液中经加热进行的一种接枝反应[25]。湿热法与干热法的基本步骤相同，也是将蛋白质和糖依比例溶解到选定pH 的缓冲液中，接着在密闭的容器中利用水浴或油浴加热进行反应，利用冰浴降温结束反应。在≤90 ℃下，湿法糖基化反应速度一般较慢，而在＞90 ℃下反应较快（24 h内）。目前糖基化法多被用于小分子糖与蛋白质间的反应[26]。值得关注的是Martins 等[27]通过构建动力学模型来预测和控制湿热法美拉德反应，这为美拉德反应过程化控制的实现提供了新思路。

2 大豆抗原蛋白对肠道的致敏损伤

大豆蛋白过敏是大豆抗原蛋白介导的机体异常免疫反应，也是婴幼儿或幼龄动物最常见的过敏类型，通常表现皮肤、胃、肠、呼吸道症状，严重者或引起休克甚至死亡，其中，肠道是受危害最为严重的器官之一[28]。由于幼龄动物的肠管尚未发育完全，消化酶分泌能力不足，肠道微生态系统不稳定等。在摄入含大豆抗原蛋白的食物后，未被降解的大豆抗原蛋白易通过跨细胞或旁细胞途径进入血液或淋巴循环，诱导机体过敏。其主要过敏类型有3 种：①Ⅰ型过敏反应：由免疫球蛋白E（IgE）介导。表现为速发型，其中肥大细胞和嗜碱性粒细胞为效应细胞，组胺与白三烯等为效应因子，是造成肠上皮细胞通透性增加和黏膜水肿的主要因子。②Ⅲ型过敏反应：由免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白M（IgM）共同介导。由免疫复合物通过激活补体系统和某些效应细胞引起充血性水肿和组织损伤。③Ⅳ型过敏反应：是由特异性淋巴T细胞介导的迟发型过敏反应。其中IgE介导的速发型过敏反应最为常见[29]。

大豆抗原过敏的婴幼儿或幼龄动物，肠黏膜上皮细胞的通透性增加，造成肠黏膜发生水肿，并破坏肠黏膜形态结构与完整性，致使肠黏膜上皮、肠绒毛萎缩缩短、隐窝加深[30]。如过敏仔猪肠上皮细胞的紧密连接蛋白ZO-1、claudin-3和occludin基因表达水平降低，通透性增加，造成肠黏膜屏障机械性损伤[31]。肠黏膜损伤募集粒细胞、淋巴细胞浸润，造成肠道的组胺释放增加，激活NF-κB信号通路，使致炎因子白细胞介素IL-1、IL-4、IL-6等表达水平升高，打破了原本的Th1/Th2和Treg/Th17细胞间的平衡，失衡的Th2细胞分泌过多的白细胞介素4（IL-4），促进IgE 的合成与分泌，使肠免疫屏障受损[32]。过敏的发生也与肠道微生物相关。儿童大豆抗原蛋白过敏时，肠道的梭菌属（Clostridium）和疣微菌科（Verrucomicrobiaceae）的丰度显著增加[33]。大豆抗原蛋白过敏的断奶仔猪肠管中双歧杆菌、乳酸杆菌数量减少，大肠杆菌丰度增加等[34]。过敏使肠道微生态屏障被破坏，引起益生菌和病原菌间的稳态失衡，进一步增加肠黏膜通透性、引发炎症反应及肠黏膜功能紊乱等不良现象，导致腹泻，生长迟缓，甚至死亡。

3 糖基化大豆抗原蛋白对肠道健康的影响

3.1 糖基化大豆抗原蛋白的低致敏性

大豆球蛋白或大豆β-伴球蛋白的致敏性和其他抗原一样都是由其抗原表位决定[1]。抗原表位按与之结合的细胞不同分为B细胞表位和T细胞表位；或按表位结构中氨基酸的连续性或不连续性分为线性表位和构象表位[35]。为了消减抗原的致敏性，必须破坏或修饰抗原表位。糖基化在大豆蛋白制品中常常发生美拉德反应，通过美拉德反应改变大豆抗原蛋白的分子结构，接入的糖链会修饰或改变抗原表位结构，从而降低蛋白质复合物的致敏性。陈晓旭等[13]将大豆β-伴球蛋白利用低温法、蒸煮法、高压灭菌法三种糖基化方法处理，通过构建的大豆β-伴球蛋白致敏小鼠模型评价了糖基化蛋白产物的致敏性，并解析了大豆β-伴球蛋白的结构变化与致敏性的关系。结果发现三种糖基化蛋白产物的致敏性显著降低，与低温和蒸煮糖基化蛋白产物对比，高压高热糖基化大豆β-伴球蛋白的表位结构破坏最显著，引起小鼠致敏反应最弱。Jürgen 等[36]采用同样的方法用果寡糖对大豆7S与11S蛋白进行糖基化修饰，证明糖基化可使其结构改变，致敏性降低了90%。布冠好等[37]利用葡聚糖分别与大豆球蛋白和大豆β-伴蛋白进行糖基化，结果发现大豆球蛋白的致敏性仅降低18.12%，大豆β-伴球蛋白降低36.90%。通过对大豆主要抗原蛋白的序列和表位模拟分析，推测出大豆β-伴球蛋白α-亚基的线性表位集中在序列的前段，而β-转角多分布于该蛋白表面，因此β-转角更容易构建抗原表位[38]。研究也表明，大豆抗原蛋白糖基化可使分子间氢键遭到破坏、作用力降低，蛋白质分子展开，使β-转角和无规卷曲数量减少，表位空间构象消失，致敏性降低[37]。

以上结果说明，大豆抗原蛋白糖基化并不能完全消除其致敏性。其主要原因在于糖基化不能破坏大豆抗原蛋白的一级结构，因此线性表位仍存在[39]；而蛋白质内部二硫键和糖基的引入也增强了抗原蛋白的热稳定性，也对表位产生保护作用；同时糖基化使大豆抗原蛋白热集聚，包埋了部分抗原表位[13]，另外，大豆球蛋白或大豆β-伴球蛋白所含的N-糖链可以诱导特定的免疫反应，对过敏发生起着重要作用[3]。如Kuhne 等[40]于2015 年发现蛋白质上的N-糖链是结合IgE的表位；除此之外，糖基化降低大豆抗原蛋白的致敏性程度还会受到糖的种类、糖基化条件（处理时间、温度、抗原蛋白/多糖值以及pH等的影响）。因此，糖基化并不能完全消除抗原蛋白的致敏性。

3.2 糖基化大豆抗原蛋白的易消化性

糖基化的蛋白质易被消化道消化和吸收。刘静媛等[41]研究表明，在模拟胃消化中，大豆蛋白-葡萄糖糖基化产物与大豆蛋白对比发现小分子量肽更多；经Caco-2单层细胞转运试验，糖基化大豆蛋白的氨基酸损失下降，吸收增加。任方林等[42]研究模拟胃肠消化大豆乳清蛋白糖基化产物时也证实，糖基化大豆蛋白的消化率提高。通常糖基化修饰提高其溶解性，且不改变大豆抗原蛋白的二级结构，但改变三级结构，使其呈“熔融”态，有利于蛋白酶的酶解消化[43]。另有试验表明，肠道菌群能够利用美拉德反应复合物作为自身合成所需的C源和N源（例如β-乳球蛋白-半乳糖/乳糖复合物）[44]，促进消化。然而，研究也表明，糖基化使大豆球蛋白或β-伴球蛋白聚集，且结构更稳定，具有抵抗蛋白质水解酶的作用[45]。

3.3 糖基化大豆抗原蛋白酶解物的抑菌特性

研究证明，酶解制备的大豆β-伴球蛋白糖肽可抑制细菌黏附并具有调节肠道屏障功能的活性。任建华[46]以大豆糖肽为试验材料研究其对病原菌黏附肠道细胞的抑制效果发现，对试验所用的大肠杆菌026（Escherichia coli026）、大肠杆菌0114（Escherichia coli0114）、肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）、鼠伤寒沙门氏菌LT2（S. typhimuriumLT2）等肠道病原菌有一定的抑制黏附作用。进一步利用高碘酸盐氧化破坏大豆糖肽中的糖链后，发现对E. coli026、E. coli0114的黏附效果明显下降，且高碘酸钠氧化大豆糖肽在增加细菌细胞膜流动性方面小于完整的大豆糖肽。这表明糖链在抑制大肠杆菌黏附中发挥了重要作用。蛋白质糖基化可产生类黑素，类黑素具有抗菌活性。同样，美拉德反应发现水溶性氨基酸-糖体系也有类黑素产生，通过抑菌试验表明，类黑素抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，但抑制金黄色葡萄球菌能力更强[47]。另外，蛋白质糖基化产生的某些副产物也具有抗菌效果，通过影响细菌胞壁、脂质、蛋白质或核酸等干预细菌繁殖[48]。因此，将糖基化蛋白质产物用作添加剂用到食品或饲料中，可以延长保质期。例如，壳聚糖糖基化蛋白作为一种抗菌复合物已成功用于食品的保鲜中[49]。研究也表明糖基化大豆β-伴球蛋白酶解产物具有抑制病原菌-特别是大肠杆菌对肠上皮细胞的黏附与感染，具有明显地改善肠道微环境、预防肠炎和调节肠黏膜屏障功能的活性。另外，基于美拉德反应的糖基化蛋白复合物由于有较好的溶解性、乳化性和抗离子强度、极端pH以及热稳定性的特性，目前作为微胶囊已被广泛应于生物活性物质、药物的递送[15]。如将葡萄糖-精氨酸糖基化复合物和聚己内酯作用制备纳米纤维薄膜，该膜具有湿润度和孔隙度，在临床上可用于伤口愈合的敷料以抑制金黄色葡萄球菌等病原菌的生长，预防肠道感染或防止肠道炎症恶化。但相对于食品工业，美拉德反应复合物在医药方面的应用还较少。

4 糖基化修饰大豆抗原蛋白的挑战与展望

糖基化修饰通过影响蛋白质结构使其具备优良的功能特性和理想的生物学活性，但其在食品或保健品中的应用仍面临挑战。第一，糖基化蛋白的褐变不可避免；第二，糖基化造成部分氨基酸损失，导致营养价值降低；第三，糖基化过程可能产生一些（如5-羟甲基糠醛、丙烯酰胺、杂环胺等）有毒副作用物质，或许存在健康风险；第四，糖基化的大豆抗原蛋白对线性表位影响较小，终产物仍具有致敏性；第五，糖基化蛋白的反应机制尚不完全清楚，反应产物组成复杂，反应条件较难控制，且与机体代谢、肠黏膜微生态平衡的关系也不完全清楚等，对其实际应用产生限制。

面对上述挑战，今后研究应重点考虑一下几个方面：第一，控制大豆抗原蛋白糖基化中的毒副反应；第二，构建糖基化反应稳态动力学模型，实现糖基化的可控；第三，开发各种精准分析与检测糖基化产物的方法；第四，探索糖基化机制，构建其构效关系；第五，深入研究糖基化产物的功能特性与生物活性以及对机体的影响，拓宽其在食品或饲料、医学、工程材料等领域的应用。另外，研究已证实，蛋白质的糖基化反应也发生在RNA上，这为其研究打开了新的领域。