粗糙脉孢菌固体发酵对杜仲叶饲用价值的影响

■张秀江 胡 虹 刘 丽 解复红 冯 菲 马 焕 郭 恒 向凌云*

(1.河南省科学院生物研究所有限责任公司，河南郑州 450008；2.河南省工业酶工程技术研究中心，河南郑州 450008）

杜仲（Eucommia ulmoides）属杜仲科、杜仲属的多年生落叶乔木，是我国特有珍稀的传统中药材。《神农本草经》记载杜仲性温、味甘、无毒。研究表明，杜仲叶不仅含有丰富的蛋白质、微量元素、维生素等营养物质[1-2]，还具备药理和生理活性功能[3-4]。杜仲叶和杜仲皮有相似的活性成分，在消炎、杀菌、抗氧化、提高机体免疫力等药理方面具备相似的功效[5]。在日粮中添加杜仲叶，能显著改善动物机体免疫功能，增强对疾病的抵抗能力，促进动物健康，提高饲料利用率，改善肉质及风味。2012 年，农业部已将杜仲叶、杜仲皮列入《饲料原料目录》。杜仲叶及其提取物作为一类功能型饲料原料，应用于猪、禽、水产动物及部分反刍动物饲料中效果显著，市场前景广阔。

木本植物中较高的木质纤维素含量往往影响单胃动物对营养物质的消化吸收。单宁易与饲料中的营养成分结合，造成营养成分利用不充分，降低饲料的营养价值，单宁含量过高还影响饲料的适口性，导致动物采食量下降[6]。杜仲叶中的植酸影响单胃动物蛋白质、矿物质代谢以及消化酶的活性。目前关于微生物发酵杜仲叶、研发优质高效杜仲饲料原料、增加其在动物养殖中的添加量和使用效果等方面的研究报道还较少。粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)是子囊菌门（Ascomycoya）、子囊菌纲（Ascomycetes）、粪壳目（Sordariales）、粪壳科（Sordariaceae）、脉孢菌属（Neurospora）的真菌，其高产纤维素酶、漆酶和多种消化酶的特性为其发酵含纤维素较高的木本植物饲料奠定了良好的基础[7-8]。本试验利用粗糙脉孢菌固体发酵杜仲叶，探讨发酵过程对杜仲叶饲用价值的影响，以期为杜仲叶在饲料中的应用提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 杜仲叶发酵饲料制备

1.1.1 菌种

试验用粗糙脉孢菌由河南省工业酶工程技术研究中心提供。将粗糙脉孢菌接种到PDA 试管斜面培养基上扩繁2次，然后无菌接种到PDA试管斜面培养基上培养24 h，备用。

1.1.2 种子培养基

葡萄糖10.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母浸粉3.0 g/L，麦芽汁3.0 g/L，磷酸二氢钾2.0 g/L，硫酸镁0.3 g/L，氯化钙0.3 g/L，硫酸亚铁5.0 mg/L，硫酸锌1.4 mg/L，硫酸锰1.6 mg/L，氯化钴2.0 mg/L，pH 5.5，121 ℃灭菌20 min，备用。

1.1.3 发酵种子液培养

500 mL 三角瓶装入200 mL 种子培养基，接入适量试管斜面种子，30 ℃、180 r/min恒温摇床培养60 h，备用。

1.1.4 原料

杜仲叶采于7 月中旬河南省罗山县莽张镇。叶片选择3～5 年生的杜仲幼树，高、中、低部位随机摘取，自然条件晾晒至含水量10%以下，粉碎过30 目筛，装袋备用。玉米粉、麸皮、稻糠为市售产品。

1.2 杜仲叶发酵试验

称取杜仲叶粉450 g、玉米粉25 g、麸皮12.5 g、稻糠12.5 g，搅拌均匀后加水使其含水量达到60%，pH自然，制成杜仲叶发酵培养基。将发酵培养基装入1 000 mL 三角瓶中，121 ℃灭菌60 min，冷却后按培养基总质量的8%接入粗糙脉孢菌发酵种子液，38 ℃恒温培养15 d，得到杜仲叶发酵培养物。

1.3 指标测定

将发酵培养物置于50～60 ℃的烘箱干燥至恒重，粉碎过40 目筛，备用。随机抽取杜仲叶发酵前培养基样品和发酵后培养物样品各200 g，分别测定营养成分、抗营养成分和功效成分含量。

1.3.1 杜仲叶营养成分含量测定

粗蛋白、游离氨基酸、粗脂肪、有机物、钙、总磷含量按GB/T 6432—2018、GB/T 30987—2020、GB/T 6433—2006、GB/T 6438—2007、GB/T 6436—2018、GB/T 6437—2018的方法进行检测。

1.3.2 发酵杜仲叶抗营养成分含量测定

粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素、植酸、单宁含量按GB/T 6434—2006、GB/T 20806—2006、NY/T 1459—2007、GB/T 20805—2006、GB 5009.153—2016、GB/T 27985—2011 的方法进行检测。

1.3.3 发酵杜仲叶功效成分含量测定

绿原酸、总黄酮按GB/T 22250—2008、NY/T 2010—2011 的方法进行检测；桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸按刘静等[9]的方法进行检测；总多酚按张琳杰等[10]的方法进行检测；番茄红素按李陈陈等[11]的方法进行检测。

1.4 数据统计与分析

数据采用DPS 9.50 统计软件进行统计分析。结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 发酵对杜仲叶营养成分含量的影响

由表1可知，发酵后杜仲叶营养成分含量发生了改变。与发酵前相比，粗蛋白含量提高13.26%，游离氨基酸含量提高1.49 倍，差异显著（P＜0.05）；粗脂肪含量降低1.79%，有机物含量提高1.51%，钙含量提高1.80%，差异不显著（P＞0.05）；总磷含量提高93.75%，差异显著（P＜0.05）。

表1 发酵对杜仲叶营养成分含量的影响（风干基础）

2.2 发酵对杜仲叶抗营养成分含量的影响

由表2可知，发酵后杜仲叶抗营养成分含量与发酵前相比，粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素、植酸、单宁含量分别降低20.64%、19.26%、20.36%、23.91%、44.71%、58.86%，差异均显著（P＜0.05）。

表2 发酵对杜仲叶抗营养成分含量的影响（风干基础）

2.3 发酵对杜仲叶功效成分含量的影响

由表3可以看出，发酵后杜仲叶中功效成分含量与发酵前相比，绿原酸含量提高57.68%，总黄酮含量提高39.66%，桃叶珊瑚苷含量降低11.54%，京尼平苷酸含量降低9.30%，差异均显著（P＜0.05）；总多酚含量降低0.34%，差异不显著（P＞0.05）；番茄红素发酵前无检出，发酵后含量达到1.86 mg/g，差异显著（P＜0.05）。

表3 发酵对杜仲叶功效成分含量的影响（风干基础）

3 讨论

3.1 发酵对杜仲叶营养成分含量的影响

杜仲叶经粗糙脉孢菌发酵，被纤维素、半纤维素和木质素紧密包裹的蛋白质充分释放出来并被降解成小肽、游离氨基酸等，其中非蛋白氮经微生物作用转化为菌体蛋白，提高粗蛋白含量。梅德洪[12]应用酵母菌和乳酸菌发酵杜仲叶，发酵后杜仲叶粗蛋白和水解氨基酸含量增加。贾金如[13]研究粗糙脉孢菌固体发酵稻草，获得稻草发酵饲料真蛋白含量达到4.78%～7.23%；与产朊假丝酵母混菌发酵，稻草发酵饲料中真蛋白含量提高147.24%，粗蛋白含量提高67.83%；与产朊假丝酵母、黄孢原毛平革菌混菌发酵，稻草发酵饲料中真蛋白含量提高123.37%，粗蛋白含量提高70.31%。吴邦国[14]通过粗糙脉孢菌发酵处理玉米秸秆，真蛋白含量提高2.73倍。叶俊等[15]、黄文利等[16]研究应用粗糙脉孢菌固体发酵豆渣，发酵培养物中粗蛋白含量由12.16%提高到23.80%。张军民等[17]、董娟娥等[18]以乳酸菌发酵杜仲叶，发酵后蛋白质含量稍有降低。王翔等[19]研究发现，杜仲叶中必需氨基酸与总氨基酸含量之比大于40%，必需氨基酸与非必需氨基酸含量之比大于60%，表明杜仲叶的蛋白属于优质植物蛋白质。本试验杜仲叶经粗糙脉孢菌发酵后粗蛋白含量由12.90%提高到14.61%，游离氨基酸含量由1.16 mg/g 提高到1.89 mg/g，蛋白质的含量和质量都得到显著提升，高于大多数禾谷类植物饲料，因此，发酵杜仲叶可以作为一定比例蛋白质来源，补充动物对蛋白质的营养需求。梅德洪[12]应用酵母菌和乳酸菌发酵杜仲叶，叶俊等[15]应用粗糙脉孢菌发酵豆渣，发酵后粗脂肪含量都得到提升。本试验结果显示发酵后粗脂肪含量有所降低，可能与粗糙脉孢菌在发酵杜仲叶的过程中消耗部分脂肪有关。发酵对杜仲叶中有机物、钙和总磷含量影响的研究报道较少，张军民等[17]、董娟娥等[18]、梅德洪[12]以酵母菌、乳酸菌发酵杜仲叶可提高杜仲叶中有机物和总磷含量。杜仲叶中的钙和磷通常以植酸盐络合物的形式存在，不但降低了钙、磷离子浓度，而且动物很难利用。粗糙脉孢菌发酵过程中分泌的植酸酶能催化植酸盐降解，增加杜仲叶中钙和磷的含量[20]。本试验结果显示发酵后杜仲叶中有机物、钙含量有所增加，总磷含量显著提高，与前述学者研究结果一致。

3.2 发酵对杜仲叶抗营养成分含量的影响

粗糙脉孢菌具有完整的木质纤维素降解酶系，培养简单且生长迅速，具备降解纤维素、半纤维素、木质素等功能。吴邦国[14]通过粗糙脉孢菌发酵处理玉米秸秆，半纤维素降解率达到39.00%，木质素降解率达到21.17%。贾金如[13]研究粗糙脉孢菌与产朊假丝酵母混菌发酵，稻草中纤维素和半纤维素含量降低15.44%和11.42%。杨风玲等[21]研究报道显示，粗糙脉孢菌对稻草粗纤维降解率为49.65%。叶俊等[15]应用粗糙脉孢菌发酵豆渣，粗纤维的降解率达到88.68%。梅德洪[12]、张军民等[17]、董娟娥等[18]应用酵母菌和乳酸菌发酵杜仲叶，发酵后杜仲叶中粗纤维、酸性洗涤纤维含量显著降低。化雪艳等[22]研究猴头菇、金针菇和平菇固态发酵对杜仲叶渣中半纤维素、纤维素和木质素降解的影响，结果表明，三种食用菌固态发酵后半纤维素含量下降51.35%～55.29%，纤维素含量下降40.70%～82.53%。任志青等[23]、于新颖[24]以粗糙脉孢菌固体发酵豆粕和菜粕，发酵过程中纤维素得到有效降解，植酸等抗营养因子含量显著降低。周小玲[20]研究发现，粗糙脉孢菌发酵过程中分泌的植酸酶能催化植物来源饲料中的植酸分解生成无机磷酸和肌酐，降低植酸含量，减轻其对日粮中蛋白质、微量元素和维生素的螯合作用，提高营养成分利用效率。含单宁多的饲料适口性差，动物不愿采食或拒绝采食。单宁具有较强收敛性，易与蛋白质结合，降低消化酶活性，不利于营养物质的消化和利用。Liu 等[25]研究发现，乳酸菌发酵可以水解谷物饲料中的单宁和植酸，增强消化酶活性，提高采食量和蛋白质利用率。董娟娥等[18]研究发现，杜仲叶经过发酵处理，含涩味的单宁被氧化，含量显著降低，适口性增强。本试验中发酵后杜仲叶抗营养成分粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素、植酸、单宁含量显著降低，与前述学者研究结果一致。

3.3 发酵对杜仲叶功效成分含量的影响

杜仲叶中除含粗蛋白、维生素和微量元素外，还富含自身独有的天然功效活性成分绿原酸、黄酮类、环烯醚萜类、多酚类等。这些功效成分的协同作用，不仅使杜仲叶具有饲用价值，同时又具有药用和保健价值，这是杜仲叶作为功能型饲料开发利用的基础。杜仲叶与杜仲皮、花和果实相比，具有更强的抗氧化活性。杜仲叶中抗氧化成分较多，如环烯醚萜类化合物、酚类、苯丙素类化合物等。酚类是其最活跃的抗氧化剂，一方面改善机体抗氧化酶活性，另一方面，多酚类金属螯合电位对铁和铜诱导的自由基反应起保护作用，酚羟基的氢与自由基结合等抑制自由基反应而起到抗氧化作用[26-28]。绿原酸作为杜仲叶中广泛存在的多酚类物质，由于含有一定量的R-OH 基，形成了具有抗氧化作用的羟基自由基，是一种有效的酚型抗氧化剂。同时绿原酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、停乳链球菌、沙门氏菌、乳房链球菌等均有一定的抑菌作用，能够缓解动物肠道氧化应激和炎症反应，维持肠道平衡和免疫功能，保障动物肠道健康[29]。桃叶珊瑚苷类化合物能够有效抑制炎症因子IL-6和白细胞介素-10的释放，同时抑制γ-干扰素磷酸化而起到抗炎作用[30]。杨志友等[31]研究杜仲叶中京尼平苷酸通过阻拦P38蛋白和P65蛋白的磷酸化，降低脂多糖诱导的促炎细胞因子白细胞介素-1β、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子的释放起到抗炎杀菌的特性。胡金家等[32]研究表明，杜仲叶中总黄酮类和多酚类化合物能增强刀豆素（CONA）对小鼠淋巴细胞的增殖反应，显著增强巨噬细胞的吞噬能力，增加血清中溶血素等免疫活性物质的含量，从而提高机体的免疫力。番茄红素（LYCOPENE）是一种由11 个共轭及2个非共轭双键组成的非环状平面脂溶性不饱和碳氢化合物，它是类胡萝卜素的一种，作为饲料添加剂，具有极强的抗氧化性、抗菌和消炎等生理活性[33]。彭密军等[34]研究报道，杜仲叶经发酵，绿原酸的含量由2.67%提高到3.01%，总黄酮的含量由5.67%提高到6.52%。黄文利等[16]以粗糙脉孢菌发酵豆渣，发酵后豆渣中总黄酮含量由0.18%提高到0.73%，总酚含量由0.05%提高到0.33%。麻啸涛[35]将杜仲微生物发酵和酶制剂联合应用，前期发酵利用菌的生长，后期利用酶制剂来酶解杜仲叶中的木质素和纤维素，有效释放杜仲的有效成分，可使杜仲叶中绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、杜仲黄酮等有效成分利用率提高4～28倍。张军民等[17]、董娟娥等[18]以乳酸菌发酵杜仲叶，发酵后京尼平苷酸、总黄酮、绿原酸、桃叶珊瑚苷等含量稍有降低。本试验发酵后杜仲叶中绿原酸和总黄酮含量显著增加，与前述大多数学者研究结果一致。桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、总多酚在新鲜杜仲叶中含量较高，发酵后含量降低，可能与三者稳定性较差，在粗糙脉孢菌发酵过程中容易被降解有关。李陈陈等[11]应用粗糙脉孢菌进行固体发酵，发酵产物中番茄红素含量达到2.45 mg/g。本试验发酵后杜仲叶中番茄红素含量达到1.86 mg/g，表明发酵过程增加了杜仲叶中具备抗氧化性、抗菌和消炎等功效成分的种类和含量，有助于提高杜仲饲料产品的应用效果。

4 结论

粗糙脉孢菌固体发酵杜仲叶对其抗营养成分进行了降解，改变了营养成分和功效成分组成和含量，有助于增强饲用价值和保健功能。未来在杜仲叶发酵领域应加强菌、酶融合等新技术的研究与推广应用，共同实现产品开发系列化、质量控制标准化、应用添加微量化，让杜仲这一古老的中国特有植物在养殖生产中应用起到提高饲料利用率、增强机体免疫力、平衡肠道菌群、改善畜产品品质的功效。