BP神经网络耦合遗传算法优化呕吐毒素降解菌发酵培养基

■杜 稳 孙 晶 赵一凡 孙长坡 尹 鹏 刘虎军*

(1.国家粮食和物资储备局科学研究院，北京 100037；2.国家粮食与物资储备局标准质量中心，北京 100037)

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol, DON）又称呕吐毒素，是一种由禾谷镰刀菌和粉红镰刀菌产生的单端孢霉烯族剧毒次级代谢产物，主要在作物生长、储藏、加工等环节造成污染[1-2]。DON 污染严重影响了粮食、饲料以及相关产品品质及质量安全，对人和动物的生命健康造成重大威胁。研究表明，长期暴露于低剂量的DON 下，人和动物会产生慢性不良反应，甚至导致癌症的发生[3-6]，当摄入过量的DON，会出现急性中毒症状，严重时导致直接死亡[7-8]。因此，去除粮油及饲料中的DON意义重大。

德沃斯氏菌（Devosiasp.）属好氧型或者兼性厌氧型革兰氏阴性菌，于1996 年由Nakagawa 等[9]根据16S rRNA序列分析和化学分类方法进行归类划分。近年研究表明该菌可以高效降解DON[10]，可以产生两种降解酶（DepA和DepB），其中DepA作为氧化酶，DepB作为还原酶，作用于DON的3位羟基，使DON发生异构化，形成具有低毒性的DON异构体（3-epi-DON），从而达到安全高效降解DON的效果[11-14]。此外，动物毒理性和安全性评价表明德沃斯氏菌低毒且安全，动物有效性评价表明它可以有效缓解DON引起的平均日增重和平均日采食量降低、肝脏肿大等症状[10，15]。目前，对德沃斯氏菌的发酵工艺研究相对较少，因此，提高菌株发酵生物量，将该菌应用于饲料中的DON降解，在畜牧生产中具有良好的应用前景。

BP神经网络（Back propagation neural network）是一种多层前反馈神经网络，可以实现从输入到输出的任意非线性映射[16]。遗传算法（genetic algorithm，GA）是依据达尔文的“适者生存”学说发展起来的一种组合优化算法，它将一组变量进行二进制编码，并将这些编码排列组合，形成基因链，并定义为个体，将一定量的个体形成种群，并在种群中将各个体进行选择、交叉、变异等操作来实现遗传机制，以适应度函数作为评价依据，不断进行迭代进化，逐渐逼近并得到最优解[17-19]。将BP神经网络与GA进行耦合，可以在试验变量组成的多维空间立体范围内进行全局寻优，从而使优化过程更加快速精准，结果具有更高的准确性。雷虹等[20]通过该方法优化细菌纤维素发酵培养基，优化后细菌纤维素产量提高了1.18倍，王云龙等[21]通过该对L-天冬酰胺酶发酵培养基进行优化，酶活较优化前提高了90.9%。

在之前的工作中，本团队筛选获得了一株高效降解DON的德沃斯氏菌D-8[22]，为提高该菌发酵培养的生物量，本研究通过单因素、正交试验以及BP神经网络耦合GA 等对该菌发酵培养基进行优化，以期获得发酵培养该菌株的最佳培养基，为该菌的后期工业化应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌种与培养基

降解DON的德沃斯氏菌D-8，由国家粮食和物资储备局科学研究院粮油加工研究所粮油真菌毒素防控实验室提供。

活化培养基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂2 g/L。

种子培养基、发酵基础培养基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L。

1.2 试剂及仪器

酵母浸粉、蛋白胨，Thermo Fisher Scientific公司；NaCl、琼脂粉，北京索莱宝科技有限公司；KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、FeSO4·7H2O、KI、MgSO4，国药集团。

Ecotron 型恒温摇床，瑞士Infors 公司；HV-110型灭菌锅，日本NIRAYAMA 公司；Evolution 300 紫外可见分光光度计，美国Thermo Fisher 公司；PP60 型pH计，德国Sartorius公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种的活化与种子液的制备

将保藏于-80 ℃冰箱的D-8菌种取出，室温解冻后在活化培养平皿上进行三区划线复苏，30 ℃培养16 h。将复苏的D-8 单菌落转划到新的活化培养基平皿上，30 ℃培养48 h 后挑取单菌落接到种子培养基中，30 ℃、220 r/min培养24 h，获得种子液。

1.3.2 发酵培养条件及生物量的测定

将种子液以5%的接种量接到无菌发酵培养基中，30 ℃、220 r/min 培养30 h，发酵结束后测定培养液生物量，并以OD600nm表示。

1.3.3 发酵培养基优化试验

1.3.3.1 碳源、氮源的筛选

以发酵基础培养基为基础，固定氮源与无机盐，分别添加20 g/L的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、麦芽糊精、甘油、麸皮、糖蜜作为碳源，研究不同碳源对D-8菌生长的影响。

以发酵基础培养基为基础，固定最佳碳源（20 g/L添加量）与无机盐，分别选择添加10 g/L 的有机氮源（胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、月示蛋白胨、鱼蛋白胨）、无机氮源（硫酸铵、尿素）、生物复合氮源（玉米浆干粉、棉籽饼粉、花生饼粉、黄豆饼粉）作为氮源，研究不同氮源对D-8菌生长的影响。

发酵生物量以OD600nm作为检测指标，以添加不同碳源、氮源的培养基作为对照，含有生物复合氮源的发酵液1 000 r/min 离心10 s 去除不溶沉淀后进行OD600nm检测。

1.3.3.2 碳源、氮源最佳添加量的优化

在发酵培养基固定无机盐的基础上，选择最佳氮源（10 g/L 添加量），分别将最佳碳源设定10、15、20、25、30、35 g/L 和40 g/L，研究最佳碳源添加量对D-8菌生长的影响。在固定无机盐的基础上，选择最佳碳源及添加量，分别将最佳氮源设定为5、10、15、20、25 g/L 和30 g/L，研究最佳氮源不同添加量对D-8 菌生长的影响。

1.3.3.3 无机盐和微量元素主要因子筛选试验

基于碳源、氮源的优化结果，选取NaCl、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4·12H2O、FeSO4·7H2O、KI、MgSO4等7 个因素，各因素分别设计高低两个水平，采用Design Expert 12.0软件进行部分因子试验设计，并进行数据分析与模型的建立，筛选影响D-8 菌生长的主要因素。7个因素的编码及水平见表1。

表1 无机盐及微量元素部分因子试验设计

1.3.3.4 无机盐及微量元素最佳添加量优化

在最佳碳源、氮源及最佳添加量的基础上，选择无机盐和微量元素主要影响因素，分别设置KH2PO4和Na2HPO4·12H2O 添加量为1、2、3、4、5、6、7、8 g/L，确定各因素的最佳添加量。

1.3.3.5 正交试验

将筛选出的碳源、氮源、无机盐作为变量，选择4 因素3水平进行正交试验，各因素及水平见表2。根据试验设计出的不同组别进行发酵试验。

表2 各因素正交表L9（34）（g/L）

1.3.4 BP神经网络模型的构建及GA优化寻优

使用Python 2.7 软件，以正交试验和结果作为训练和测试数据样本，根据培养基各组分和发酵生物量确定神经网络的输入输出，构建BP 神经网络，并用GA 对神经网络的初始权值和阈值进行优化，通过对培养基各因素全局寻优确定最佳培养基配比。

1.3.5 数据分析

所有试验重复3 次取平均值，试验数据采用Design Expert 12.0进行统计学分析，两组数据的比较采用独立样本T检验进行分析，显著性水平设定为0.05；3组数据间的比较采用单因素方差分析的Duncan’s法进行两两比较，显著性水平同样设定为0.05。

2 结果与分析

2.1 碳源、氮源的筛选

不同碳源对D-8 菌生长的影响结果如图1a 所示，糖蜜作为碳源时，D-8 菌的生物量显著高于其他碳源（P＜0.05），OD600nm为10.36；其次为蔗糖，说明以蔗糖为主的碳源更有利于该菌的生长。不同氮源对D-8菌生长的影响结果如图1b所示，当酵母浸粉作为氮源时，D-8 菌的生物量显著高于其他氮源（P＜0.05），OD600nm为9.39。而利用无机氮源及其他有机氮源效果相对较差，说明其利用大蛋白能力及氮转化能力较弱。

图1 碳源、氮源的筛选

2.2 碳源、氮源最佳添加量的优化

碳源的最佳添加量由图2a 可见，随着糖蜜添加量的增加，D-8菌的生物量随之增加，当糖蜜添加量为25 g/L时生物量最大，OD600nm为12.49，随着糖蜜添加量的继续增加，生物量逐渐下降，由此可见，糖蜜的适宜添加范围为20～30 g/L。氮源的最佳添加量由图2b可见，随着酵母浸粉添加量的增加，D-8菌的生物量随之增加，当氮源添加量为10 g/L 时生物量最大，OD600nm为12.62，随着酵母浸粉添加量的增加，生物量逐渐下降。由此可见，酵母浸粉的适宜添加范围为10～20 g/L。

图2 碳源、氮源最佳添加量

2.3 无机盐和微量元素主要影响因子筛选试验

为避免在后期优化试验中由于因子数太多或部分因子不显著而浪费试验资源，采用多因素部分因子试验设计从众多因素中快速有效地筛选出对试验结果有显著影响的因素。采用Design Expert 12.0软件进行多因素部分因子试验设计，试验设计及结果见表3，各因素的主要效应分析见表4。通过方差分析，模型的F值为5.21，P＜0.05，表明模型显著。根据P值可以看出，各无机盐及微量元素的显著因素为B（KH2PO4）、C（K2HPO4）、D（Na2HPO4·12H2O）。根据方差分析得到各因素的回归方程：Y=9.105 13-0.318A+0.597B-0.54C+0.652D-0.206E-0.358F-0.04G。由方程各因素系数可见，K2HPO4为负效应，KH2PO4和Na2HPO4·12H2O 为正效应，所以对这两个正效应因素进行研究。

表3 主要因子筛选两水平部分试验设计及结果

表4 主要因子筛选试验结果显著性分析

2.4 无机盐最佳添加量优化

无机盐的最佳添加量如图3所示，随着KH2PO4添加量的增加，D-8 菌的生物量随之增加，当其添加量为4 g/L 时，生物量达到最大值，OD600nm为12.55，此后逐渐下降。随着Na2HPO4·12H2O 添加量的增加，D-8菌的生物量随之增加，当其添加量为6 g/L时，生物量达到最大值，OD600nm为13.4，此后逐渐下降。通过单因素优化后，KH2PO4和Na2HPO4·12H2O的最佳添加量分别为4 g/L 和6 g/L，KH2PO4的添加范围为3～5 g/L，Na2HPO4·12H2O的添加范围为5～8 g/L。

图3 无机盐最佳添加量

2.5 正交试验结果及方差分析

以D-8 菌发酵后的生物量（OD600nm）为指标进行正交试验，以获得各组分在不同浓度下的试验数据结果，每个试验重复3 次，结果取平均值，结果见表5。由试验结果可以看出，第6 组试验的发酵结果最佳，D-8 菌的最大生物量为13.778。根据极差可以看出4 个因素对D-8菌生长的影响主次顺序分别为糖蜜＞KH2PO4＞酵母浸粉＞Na2HPO4·12H2O。

对正交试验结果进行方差分析，因为4因素的正交表试验误差自由度为1，各因素变异来源的F值不灵敏且不显著，通过分析正交试验结果，Na2HPO4·12H2O添加量变化对试验结果的波动影响最小，所以将该因素的各变异项的离差平方和和自由度并入误差项的平方和及自由度，从而提高假设检验的灵敏度，通过方差分析，结果见表6。由表6 可见，糖蜜添加量变化对D-8菌的生长具有显著性（P＜0.05），酵母浸粉和KH2PO4的添加量变化对D-8菌的生长不显著（P＞0.05）。

表6 D-8菌发酵正交试验方差分析

2.6 BP神经网络耦合GA优化最佳培养基配方

2.6.1 BP神经网络模型的建立

在正交试验中，各个因素浓度梯度设置较大，为更加快速、精准地优化各组分的最佳配比，以发酵培养基组分（糖蜜、酵母浸粉、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O）作为BP 神经网络的输入神经元，以发酵后D-8 菌的生物量（OD600nm）作为输出神经元，以表5 中9 组正交试验及结果作为训练集，构建拓扑结构为4-N-1 的神经网络。将变量数据进行归一化处理，收敛精度在[0,1]之间，输入层-隐含层以tansig函数传递，隐含层-输出层以pureline 函数传递，训练函数为梯度下降函数trainlm，设置最大迭代次数1 000 次，学习目标为10-3，学习率为0.1。以训练误差大小作为指标，经过训练后，确定隐藏神经元节点数为10个，训练拟合决定系数R2为0.910 88，说明经网络结构能较好地对数据样本进行拟合，实测值和预测的结果见图4。

图4 实测值与预测值比较

2.6.2 BP神经网络耦合GA的优化结果及验证

R2作为决定系数评价神经网络模型的好坏，R2越接近1，说明构建的神经网络模型越好。在构建BP神经网络的过程中，神经网络的初始权值和阈值是随机产生的，所以为了使构建的神经网络拟合更加精确，使用GA优化对BP神经网络的权值和阈值进行优化，以得到最佳的权值和阈值，从而构建拟合更加精确的BP神经网络。设置GA的初始化种群规模为50，遗传代数100代，GA采用ga函数，经过选择、交叉和变异，通过遗传迭代57次，适应度达到最大值，误差平方和达到最小且趋于稳定，迭代曲线见图5，GA优化后得到最佳模型。将培养基4种组分分别选择合适的步长并进行全局寻优，在53 361种组合中选择最大的预测值即OD600nm为14.53，4种培养基组分为：糖蜜30 g/L，酵母浸粉20 g/L，KH2PO44.4 g/L，Na2HPO4·12H2O 7 g/L。利用此配方重复3次进行验证试验，发酵结束后，D-8菌的OD600nm为14.68，与预测值较为接近，说明该优化网络模型可以有效地预测D-8菌的最佳培养基。

图5 遗传迭代图

3 讨论

邹球龙等[23]的研究表明，蔗糖可以作为有效碳源应用于德沃斯氏菌的培养基优化，本研究中优化的最佳碳源为糖蜜，糖蜜中总糖含量为40%～50%，且主要为蔗糖（30%～40%），说明该菌可以很好地利用蔗糖作为碳源，这与邹球龙等[23]的研究结果相一致。此外，糖蜜作为碳源较蔗糖效果更佳，分析原因，糖蜜作为蔗糖生产加工的副产物，其主要成分除糖类之外还含有蛋白质及丰富的微量元素和活性物质[24]，能有效地促进该菌的生长；并且在工业生产中，糖蜜的价格相较于蔗糖更加低廉，有利于降低发酵生产成本。优化的最佳培养基中无机盐为KH2PO4、Na2HPO4·12H2O，而这两个组分是磷酸缓冲液的主要成分；通过优化，这两个组分以一定比例组合，构成了适用于该菌发酵生长的缓冲体系，在菌体发酵培养的过程中，调控了发酵液中的酸碱环境和渗透压，从而使D-8菌的发酵生物量得以增加。

以正交试验及结果作为训练样本进行BP神经网络构建，并耦合GA对该模型进行优化后全局寻优，得到最佳发酵培养基配方，并以该配方进行验证，D-8菌生物量（OD600nm）为14.68，与模型预测值相差1.01%，说明优化后的模型可以有效地预测该菌株的最佳培养基。该菌培养基优化前生物量仅为2.137，正交试验优化后生物量为13.778，而BP 神经网络耦合GA优化后，生物量是优化前的6.87倍，比正交试验提高了6.55%，较正交试验结果显著提高（P＜0.05），说明该方法能更为有效地优化了D-8 菌的培养基配比。后续将在此配方的基础上，进行发酵条件的优化及规模化发酵放大，以进一步提高该菌的生物量，为该菌在粮油加工及饲料生产行业生物法脱除DON提供有力帮助。

4 结论

本研究对一株可以降解DON 的德沃斯氏菌D-8进行发酵培养基优化，以该菌发酵生物量（OD600nm）作为考察指标，通过单因素试验和部分因子设计试验，筛选并确定了发酵培养基的碳源、氮源、无机盐及各组分的浓度范围。以正交试验及结果作为训练样本进行BP神经网络模型构建，并耦合GA对该模型进行优化后全局寻优得到最佳的培养基配比：糖蜜30 g/L、酵母浸粉20 g/L、KH2PO44.4 g/L、Na2HPO4·12H2O 7 g/L，生物量为14.68。该培养基配方为D-8菌株后续规模化发酵生产及应用提供了数据支撑。