LncRNA H19通过调节miR-let7/MMP-9分子轴促进滋养细胞侵袭及迁移*

刘明嫦,刘师玚,马 敬**

(1.昆明医科大学第一附属医院，昆明 650031；2.云南省妇幼保健院，昆明 650051)

妊娠期高血压疾病(hypertensive disorders of pregnancy,HDP)是以血压升高(收缩压≥140mmHg，舒张压≥90mmHg)，不出现(妊娠期高血压)或出现(子痫前期)蛋白尿(大于0.3g/24h)为特征的一组妊娠期特发的临床综合征。HDP可继发母亲高血压脑病、脑出血、心力衰竭、肾功能衰竭、多器官功能衰竭，导致胎儿宫内发育迟缓、胎儿脐血流异常、慢性胎儿宫内窘迫，是医源性早产的主要原因。HDP治疗极为棘手，发病机制复杂，目前病因尚未完全阐明。既往研究认为,在母胎循环建立的过程中，绒毛外滋养细胞侵袭能力受损，造成“胎盘浅着床”和子宫螺旋动脉重塑障碍，是HDP发病的一个重要的原因[1]。深入研究绒毛外滋养细胞侵袭能力，可为临床早期发现、治疗HDP提供理论依据。

人类H19基因的转录产物是一种lncRNA，在人早期胎盘组织中丰富表达，生后常消失。LncRNA H19作为分子海绵吸附并抑制miRNA与靶基因的结合，促进肿瘤细胞的侵袭[2]。胎盘的种植过程类似于肿瘤的侵袭过程，胎盘中lncRNAs差异性表达与子痫前期(preeclampsia,PE)发病有关。但lncRNA H19在HDP中的表达情况存有争议。既往研究报道，HDP胎盘组织中H19表达水平明显低于正常胎盘[3]。最近有报道，PE孕妇妊娠早期血液中H19表达水平显著上调[4]。本研究旨在明确H19在HDP胎盘中的表达情况，并进一步探讨H19参与HDP发病的具体机制。

miRNA能与mRNA的3'非翻译区结合，通过调节mRNA稳定性和抑制翻译控制基因表达，进而参与肿瘤的发生[7]。目前关于miR-let7e-5p在HDP发病中具体作用机制的研究较少。PE孕妇的miR-let7表达水平发生了改变，但不同亚型报道的结果不一致。研究发现，miR-let7a及miR-let7g在重度子痫前期(severe pre-eclampsia,sPE)中明显升高[5]。李晓娟等[6]发现，miR-let7b-5p及miR-let7e-5p在sPE胎盘中表达减少。本课题组前期研究发现，H19基因内包含有miR-let7的多个结合位点[7]，预测H19可能通过吸附miR-let7调控下游靶基因，进而参与HDP的发病。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)在肿瘤侵袭转移中起作用，参与滋养细胞侵入子宫蜕膜和肌层及子宫螺旋动脉的重塑过程[8]。MMP-9表达水平与滋养细胞侵袭力和血管重铸水平正相关，HDP中MMP-9表达下调[9]。在脂肪来源的干细胞中，MMP-9是受miR-let7e调控的下游靶基因[10]。目前尚不清楚miR-let7是否通过调控MMP-9表达进而参与HDP的发病。

本研究通过检测HDP胎盘组织中lncRNA H19、miR-let7、MMP-9 mRNA、MMP-9蛋白表达，并根据临床标本检测结果进行体外细胞实验，探索HDP发病机制。

1 资料与方法

1.1 临床标本及细胞 收集2019年12月至2021年3月在昆明医科大学第一附属医院分娩的HDP孕妇86例和正常孕妇20例。86例HDP孕妇中，妊娠期高血压26例(PIH组)，子痫前期29例(PE组)，重度子痫前期31例(sPE组)，其中早发型8例、晚发型23例。分娩时收集胎盘组织，剪成约1cm×1cm×1cm大两块，一块置-80℃冰箱冻存备检，另一块放入10%福尔马林溶液固定24h后石蜡包埋。HTR8/Svneo细胞株购自武汉普诺赛，传代并保存于昆明医科大学科研实验中心。本研究经医院伦理委员会同意，孕产妇均签署知情同意书。根据临床标本实验结果，从miR-let7b-5p和miR-let7e-5p两者中，筛选出与疾病发展相关且与lncRNA H19负相关性更强的miRNA，进行后续研究探索其作用机制。

1.2 主要试剂 1640培养基(gibco 126 31200-022，美国)、10% 胎牛血清(FBS)(gibco 10099-141,America)和青霉素-链霉素(100U/mL,1∶1)(gibco 1902417,America)混合物培养人滋养层细胞HTR-8/SVneo。细胞在37℃、5% CO2培养箱中培养。H19过表达质粒(pexH19)、空质粒购自汉恒生物，siH19和siCon购自锐博公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞转染 将HTR/SVneo细胞分组：对照组(NC组)，转染空质粒组(NC+empty质粒)，转染siH19敲低H19组(siH19组)，用过表达H19质粒转染过表达H19组(NC+pEX-H19组)，用miR-let7e-5p模拟物和含H19的质粒转染滋养细胞(pEX-H19+let-7e组)。siRNA和miRNA转染按riboFECTTMCP转染试剂盒说明书进行。转染质粒DNA按lipofectamineTM3000试剂盒(质粒浓度2500ng/孔)说明书进行。转染后48h，收集细胞用于进一步实验。

1.3.2 细胞活性测定 使用细胞计数试剂盒8(CCK-8，同仁化学，日本)测定。将HTR-8/SVneo细胞接种到96孔板(1500细胞/孔)，在1640培养基置37℃、5% CO2培养箱培养24h。HTR-8/SVneo细胞转染48h，将CCK-8试剂(10μL/孔)加入细胞，置37℃和5%CO2培养箱孵育2h。使用酶标仪检测450nm处吸光度。

1.3.3 细胞划痕试验 将细胞浓度调整为2.5×104/mL，并接种到Ibidi插件的左右孔中。培养细胞，直至细胞达到95%融合，用PBS液洗涤细胞，拔除Ibidi插件后0、24h在倒置显微镜下观察划痕宽度并拍照。

1.3.4 Transwell试验 用24孔板进行。每个孔板使用Matrige基质胶(50μL/孔，corning，356234，美国)包被。转染48h后，将细胞接种到24孔板。将1×105细胞/mL细胞悬液100μL加入上室，使用无血清培养基培养。将10%FBS培养基500μL加入下室，孵育24h。去除膜上表面的非侵入细胞和基质胶。膜下表面用4%多聚甲醛固定细胞30min，用结晶紫染色15min。使用100倍显微镜拍照，使用Image J软件进行细胞计数。

1.3.5 逆转录实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR) 通过Trizol试剂(Lifetech，美国)从胎盘组织或滋养层细胞中提取RNA。使用FastKing RT(With gDNase) FastKing cDNA第一链合成试剂盒(天根，中国)将mRNA逆转录为cDNA。使用RiboTMmRNA /lncRNA qPCR Starter Kit(锐博,中国)检测lncRNA H19。使用Bulge-Loop miRNA RT-qPCR试剂盒检测miR-let7b-5p和miR-let7e-5p，使用Starter Kit Bulge-Loop miRNA RT-qPCR Starter Kit(锐博,中国)进行逆转录。实验方法按试剂盒说明书进行。H19和let7引物购自锐博(中国广州)。MMP-9 mRNA和GAPDH引物由Beacon Designer 7.90设计，由Invitrogen(中国广州)合成。RT-qPCR使用SYBR Green master的Cycle 96实时PCR系统(LightCycle，瑞士)完成。lncRNA和mRNA的定量通过使用GAPDH作为内参；miRNA的定量由U6作为内参。采用相对定量方法(2-△△ct)分析数据。

1.3.6 免疫组化(包含IHC)检测 人胎盘组织固定，包埋，切成4μm切片，脱水，用中性树胶封闭。经脱蜡、复水、柠檬酸缓冲液浸泡，微波10min修复抗原。3%过氧化氢孵育30min，5%山羊血清25℃封闭1h，用抗MMP-9(abcam)抗体孵育过夜。山羊抗兔二抗与切片25℃孵育1h。用PBST洗涤，DAB溶液处理。用显微镜观察和成像人胎盘中MMP-9蛋白表达。使用Image J用于测量图像的灰度。

2 结 果

2.1 临床特征 进行年龄、分娩前体质量指数(body mass index,BMI)匹配后，PIH组、PE组、sPE组的收缩压、舒张压均高于正常妊娠组(P<0.001)；早发型、晚发型sPE组的新生儿出生体重均显著低于正常组(P<0.001，P<0.05)；早发型、晚发型sPE组的分娩孕周显著低于正常妊娠组(P<0.001，P<0.05)。见表1。

表1 各组患者临床特征

2.2 免疫组化检测HDP患者胎盘组织中MMP-9蛋白表达 免疫组化结果显示，MMP-9蛋白在合体滋养细胞的细胞膜、细胞外基质中表达；MMP-9蛋白在中性粒细胞膜上表达；PIH、PE、sPE胎盘中滋养细胞数减少，MMP-9阳性细胞少，坏死增多，出现较多中性粒细胞。PIH胎盘组织中MMP-9蛋白表达明显低于正常组，且PE及sPE组均显著低于PIH组。见图1、2。

图1 PIH、PE和sPE患者胎盘组织中MMP-9蛋白表达比较

图2 免疫组化法检测MMP-9蛋白在PIH、PE和sPE胎盘中的表达(×400)

2.3 RT-qPCR检测HDP胎盘中lncRNA H19、miR-let7、MMP-9表达 与正常妊娠组比较，HDP患者中lncRNA H19表达水平显著升高，miR-let7b-5p、miR-let7e-5p水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与正常妊娠组比较，PIH和sPE组胎盘组织中MMP-9 mRNA表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。早发型和晚发型sPE患者的lncRNA H19、miR-let7e-5p表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)，早发型sPE中miR-let7b-5p、MMP-9表达低于晚发型sPE，差异有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关性显示，lncRNA H19与miR-let7e-5p、MMP-9 mRNA均呈负相关(r=-0.54,P<0.01；r=-0.229,P<0.05)，见图3。

图3 胎盘组织中lncRNAH19、miR-let7b-5p、miR-let7e-5p和MMP-9 mRNA表达

2.4 lncRNA H19对滋养细胞侵袭力、迁移力及细胞活力的影响 在HTR/SVneo细胞中，过表达H19后，滋养细胞的穿膜细胞数、滋养细胞迁移率及细胞活力均增强；敲减H19后，滋养细胞的穿膜细胞数、滋养细胞迁移率及细胞活力均减弱。表明lncRNA H19促进了滋养细胞的侵袭力、迁移力及细胞活力。过表达H19与miR-let7e-5p mimics共转染后，lncRNA H19对滋养细胞的侵袭力、迁移力及细胞活力的促进作用被逆转，表明人滋养细胞中lncRNA H19抑制miR-let7e-5p表达、上调MMP-9表达，进而促进滋养细胞的侵袭力、迁移力并增强细胞活力。见图4。

图4 细胞的侵袭力、细胞活力及迁移力

2.5 HTR/SVneo细胞中H19、miR-let7b-5p、miR-let7e-5p、MMP-9 mRNA表达 在HTR/SVneo细胞中过表达H19后，miR-let7e-5p表达下降，lncRNA H19及MMP-9 mRNA表达增加；敲减H19后，miR-let7e-5p表达增加，lncRNA H19及MMP-9 mRNA表达减少。表明lncRNA H19抑制miR-let7e-5p表达，促进MMP-9表达。过表达H19与miR-let7e-5p mimics共转染后，lncRNA H19表达量高于pEX-H19组，MMP-9 mRNA表达低于pEX-H19组。表明miR-let7e-5p增加反向促进了H19表达增加，LncRNA H19与miR-let7e-5p之间为内源性竞争性RNA；lncRNA H19对MMP-9 mRNA的促进作用受miR-let7e-5p影响，miR-let7e-5p可能抑制MMP-9 mRNA表达。见图5。

图5 滋养细胞中H19、miR-let7e-5p、MMP-9 mRNA表达

3 讨 论

PIH及PE与胎盘滋养细胞植入异常有关[11]，在人类胎盘形成早期，H19呈双等位基因表达；10周后，H19仅在母系表达，父系沉默[12]。目前关于lncRNA H19参与HDP发病的机制还不清楚。本研究发现，PIH及PE胎盘组织中lncRNAH19均表达升高，lncRNA H19具有促进滋养细胞的侵袭力、迁移力和细胞活力的作用，表明lncRNA H19表达可能通过影响滋养细胞的功能参与HDP发病。

既往研究发现,H19基因上存在多个miR-let7的靶点。本研究发现，PIH、PE、sPE胎盘组织中miR-let7b-5p及miR-let7e-5p均表达降低,尤以早发型sPE胎盘中miR-let7b-5p表达最低，miR-let7e具有抑制滋养细胞的侵袭力、迁移力和细胞活力的作用，提示miR-let7差异性表达可能与HDP发病相关,并且与疾病的严重程度有关。

MMP-9是溶解细胞外基质的蛋白酶，是滋养层侵袭能力的代表分子[13]。本研究发现，在PIH及sPE胎盘中，MMP-9 mRNA均表达下降，尤以早发型sPE胎盘中下降最显著。此外，MMP-9蛋白在PIH、PE及sPE胎盘组织中表达下降。值得注意的是，PE胎盘中MMP-9 mRNA表达与正常组无明显差异，但MMP-9蛋白表达明显下降，表明MMP-9 mRNA可能在转录后水平受到损伤。滋养细胞中MMP-9表达受到lncRNA H19的促进，进而增强滋养细胞的侵袭、迁移和细胞活力；miR-let7e-5p抑制MMP-9表达，提示MMP-9 mRNA可能是miR-let7e-5p的下游靶基因。综上，滋养细胞中MMP-9表达可能在转录或转录后水平被破坏，并参与PIH及PE的发病，且因病情程度不同呈动态变化。

绒毛外滋养细胞侵袭能力差导致螺旋动脉重构不足，从而导致PE。H19促进了绒毛外滋养细胞系HTR-8/SVneo的侵袭、迁移和细胞活力，但结果显示lncRNA H19在HDP胎盘中表达上调。HTR-8/SVneo是一种来源于早孕期人类滋养细胞的细胞系。本实验通过敲减H19导致HTR-8/SVneo细胞侵袭能力下降，模拟了PIH及PE胎盘早期变化。结果显示，MMP-9 mRNA表达下调，滋养层侵袭能力减弱。但孕晚期胎盘中H19与MMP-9 mRNA表达呈轻度负相关，提示存在人体负反馈调节作用，即低水平MMP-9 mRNA可能重新激活H19表达。因而在PE胎盘中，lncRNA H19的上调促进了MMP-9 mRNA的表达，使其与正常组的表达无明显差异。但在sPE胎盘中，尤其是早发型sPE，胎盘代偿能力严重下降甚至消失，MMP-9 mRNA降至最低水平。本研究发现，H19在HDP中上调可能是HDP胎盘代偿的表现。

本研究发现，H19与let-7e共表达时，miR-let7e-5p对lncRNA H19存在一定的正反馈作用。可能是因miR-let7e-5p具有抑制滋养细胞的侵袭力、迁移力及细胞活力的作用，转染miR-let7e-5p进入滋养细胞后，细胞发生“自救”，上调lncRNA H19表达，以对抗miR-let7e-5p对细胞的“损伤”，但具体机制有待进一步研究。

综上所述，在胎盘形成早期，滋养细胞H19表达下调，MMP-9表达下调，侵袭力下降，胎盘浅着床，导致HDP发病。疾病进展过程中，低水平MMP-9负反馈激活lncRNA H19表达，通过抑制miR-let7，进而促进MMP-9表达，影响滋养细胞的侵袭力、迁移力及细胞活力，从而影响HDP病程进展。本研究将为探索HDP的早期预测、早期诊断和治疗提供理论依据。