N-乙酰基转移酶2基因分型与抗结核药物性肝损伤的关系研究

毛玉巧 邱小惠 何梦玲 付喜花 麦艳君

结核病发现至今已有140余年,是一种古老的传染病,几乎与人类“相伴”。而异烟肼(isonicotinic acid hydrazide,INH)在人类抗击结核病一线治疗中占据近70年历史,一直发挥关键作用。但是药物代谢动力学及肝酶代谢的差异导致不同个体之间INH药物浓度差异较大,低浓度影响治疗效果,但是高浓度亦可导致肝损伤及死亡。目前一些影响药物代谢基因位点已经被发现,但这些基因位点在预测INH所致肝损伤中的临床应用仍不确定。N-乙酰转移酶2(N-acetyltransferase 2,NAT2)是一种主要存在肝细胞内的非微粒体酶,主要催化乙酰基从乙酰辅酶A转移形成乙酰化衍生物,在人体内参与多种药物的代谢。尽管个体的乙酰化剂状态(快或慢)被怀疑是INH诱导的肝毒性的潜在危险因素,但考虑到这些早期研究的结果差异很大,且存在相当大的争议和不确定性。因此本研究分析NAT2基因多态性的频率、NAT2乙酰化状态及其与INH药物不良反应发生率的关系,探索药物引发肝损伤的机制及相关危险因素,对降低相关不良反应发生风险,更好的控制结核疫情非常必要。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年11月～2021年5月入住广州市番禺区中心医院的肺结核病初治患者73例,均征得患者知情同意。纳入标准：所有患者初始基线均无明显肝损伤,均采用焦磷酸直接测序法进行NAT2基因分型。排除标准：合并其他肝脏疾病、使用其他肝毒性药物及预防使用护肝药物者。

1.2 方法 初始治疗采用标准一线方案：INH 0.3 g/d,利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺按照患者体重计算给药。四药联合强化规律治疗2个月,然后评估患者病情选择后续治疗方案。初始治疗2个月后采用《抗结核药物性肝损伤诊治指南(2019年版)》［1］中血清生化标准进行评估：ALT≥3倍正常上限(ULN)和(或)TB ≥2倍ULN,或者AST、ALP和TB同时升高,且至少 1项≥2倍ULN,即为抗结核药物性肝损伤。

目前基因直接测序法为现有技术中所能达到的最先进水平,最接近客观事实,是分子诊断的金标准,而基于焦磷酸测序法的高通量基因组测序系统,为第二代测序的先锋,本试验采用PyroMark Q24实时定量焦磷酸序列分析仪(德国QIAGEN),配合试剂盒(长沙三济生物有限公司),由临床医生开具检测申请单、护士用紫帽抗凝管取血、标本送至中心实验室后进行DNA提取、聚合酶链式反应(PCR)扩张后予焦磷酸直接测序,操作简单,检测速度快。目前发现人类NAT2至少存在7个基因突变点,G191A、C282T、T341C、C481T、G590A、A803G和G857A,临床上推荐检测C282T、T341C、G590A和G857A 4个有意义的突变位点。

1.3 观察指标及判定标准 对73例结核病患者进行NAT2基因测序分型,对C282T、T341C、G590A和G857A 4个单核酸多态性位点进行分析比对,判定NAT2基因型及代谢表型。分析患者的一般资料、NAT2相关基因多态性分布情况,比较不同NAT2基因代谢分型患者的药物性肝损伤情况及临床效果。代谢表型判定标准：NAT2基因代谢表型简单分为以下3种［2］：①快代谢型：正常野生型纯合子,具有两个野生等位基因；②中间代谢型：突变杂合子,含有1个使酶活性减弱或者丧失的突变等位基因；③慢代谢型：突变纯合子,含有≥2个使酶活性减弱或者完成丧失的等位基因。观察NAT2基因不同代谢表型抗结核治疗临床效果,疗效判定标准：动态监测初始治疗2个月内患者影像学及痰涂片抗酸染色检查结果,初始治疗痰涂阳性患者转阴,或者初始治疗痰涂阴性患者影像学表现明显改善均视为治疗好转。

1.4 统计学方法 采用SPSS26.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验；计算各基因型风险系数(odds ratio,OR)及95%可信区间(95%CI),分析疾病与基因的关联强度。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料 本试验纳入初治结核患者73例,其中男54例,女19例,年龄20～89岁,治疗2个月后发生药物性肝损伤22例(30.14%)。药物性肝损伤患者的年龄和基础ALT、AST、TB水平及随访ALT、AST、ALP、TB水平均显著高于无药物性肝损伤患者,差异具有统计学意义(P＜0.05)；药物性肝损伤患者和无药物性肝损伤患者的性别、基础ALP水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 有无药物性肝损伤患者的临床资料比较［±s,n(%)］

表1 有无药物性肝损伤患者的临床资料比较［±s,n(%)］

注：与无药物性肝损伤患者比较,aP＜0.05

项目类别药物性肝损伤患者(n=22)无药物性肝损伤患者(n=51)t/χ2P年龄(岁)63.55±4.64a58.75±7.892.6560.010性别男19(86.36)35(68.63)2.5110.113女3(13.64)16(31.37)基础肝功能ALT(U/L)39.09±26.57a 19.75±12.494.2470.000 AST(U/L)38.36±23.65a 27.12±14.742.4690.016 ALP(U/L)105.91±24.87 96.77±47.250.8550.395 TB(μmol/L)13.71±5.62a10.68±4.832.3400.022随访肝功能ALT(U/L)212.68±227.64a 25.70±20.515.8650.000 AST(U/L)169.82±154.54a 30.33±20.546.3740.000 ALP(U/L)145.13±52.50a101.86±45.563.5550.001 TB(μmol/L)31.11±35.63a10.54±4.794.0750.000

2.2 73 例患者的NAT2相关基因多态性分布情况分析 73例患者的NAT2相关基因多态性分布情况见 表2。

表2 73例患者的NAT2相关基因多态性分布情况分析(n,%)

2.3 不同NAT2基因代谢分型患者的药物性肝损伤情况比较 73例患者NAT2基因代谢分型中占比由高到低依次为中间代谢型32例(43.84%)、快代谢型24例(32.88%)、慢代谢型17例(23.29%)；药物性肝损伤患者和无药物性肝损伤患者的NAT2基因代谢分型比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。快代谢型患者发生药物性肝损伤的风险最低(OR=0.344,P=0.079＞0.05),而慢代谢型患者出现药物性肝损伤的风险最高(OR=5.238,P=0.003＜0.05)。见表3。

表3 不同NAT2基因代谢分型患者的药物性肝损伤情况比较(n)

2.4 不同NAT2基因代谢分型患者的临床效果比较 所有患者随访2个月,总好转率为65.75%(48/73),其中慢代谢型患者的治疗好转率88.24%(15/17)明显高于快代谢型的58.33%(14/24)、中间代谢型的59.38%(19/32),差异有统计学意义(P＜0.05)。见表4。

表4 不同NAT2基因代谢分型患者的临床效果比较［n(%)］

3 讨论

自1882年罗伯特·科赫首次发现结核杆菌以来,人类一直与结核不懈地斗争,结核防治工作至今已经取得了一定的成绩,但目前结核病仍然是危害全球多数国家人民健康的重大公共卫生问题之一［3］。抗结核药物治疗为当今最重要的结核防治措施,抗结核治疗需要多药联合,因抗结核药物长疗程、大剂量等特点,常引发一系列不同的药物不良反应,有研究表明因结核药物不良反应退出治疗的患者达到22.58%［4］。药物不良反应中肝功能损伤最常见,文献报道,抗结核药物性肝损伤的发生率为 2.0%～28.0%［5-7］。在老年患者中这一问题更加明显［8］。本研究中,肝损伤患者比例达30.14%,可能与本实验纳入患者平均年龄＞55岁有关,与宋秀丽等［9］的研究结果相近。

近年来人类一直为不断提高抗结核治疗效果,同时最大程度减少药物毒副作用,减轻患者痛苦努力。因INH其具有强大的杀菌活性,一直作为抗结核治疗的长期关键性一线药物,近年来相关研究发现INH药物代谢具有明显的个体差异性［10］。肝损伤及耐药菌的出现越来越被重视。这些差异随后归因于NAT2基因遗传变异,经典的N-乙酰化多态性来自于变异的NAT2等位基因不同表型。NAT2是一种胞质Ⅱ相结合酶,主要负责INH失活［11,12］。N-乙酰化能力的遗传差异也导致了相应INH生物转化代谢的差异［13］。本研究中,以焦磷酸直接测序法分析NAT2的基因表型。结果显示NAT2基因快代谢型24例,占比32.88%；中间代谢型32例,占比43.84%；慢代谢型17例,占比23.29%,与亚洲统计大数据一致［14］。

本研究通过追踪分析,发现乙酰化多态性与INH不良反应的高发生率有关,NAT2基因快代谢型患者发生药物性肝损伤风险最低(OR=0.344,P=0.079＞0.05),而慢代谢型患者发生药物性肝损伤风险最高(OR=5.238,P=0.003＜0.05)。有研究表明,根据不同 NAT2基因型调整药物剂量,对慢代谢型患者减少INH剂量,而对快代谢型患者相应增加INH剂量,其他药物不变,结果提高早期疗效同时,也减少了药物性肝损伤的发生［15］。本研究中治疗2个月后评价治疗效果,NAT2基因慢代谢型治疗好转率明显高于快代谢型与中间代谢型,差异有统计学意义(P＜0.05)。除了NAT2基因表型外,老年、酗酒、合并嗜肝病毒感染或其他急慢性肝病、营养不良、自身免疫功能异常等也是肝功能损伤的危险因素［1］。

综上所述,在临床治疗中需要综合考虑患者病情选择治疗方案,根据患者不同的基因表型及个体综合状态精确调整药物剂量,如果有条件可同时进行药物浓度监测,可有效降低药物性肝损伤发生率,同时也可以更好提高临床治疗效果,有利于改善患者治疗依从性,提高临床治愈率。