苦菜硒蛋白饲料添加剂制备及抗氧化性研究

冯谈林，杨秦玉，韩淑雅，侯 晟，贺 莹

（吕梁学院生命科学系，山西吕梁 033000）

苦菜为菊科一年生或多年生草本植物，具有抗氧化、抗炎、抗菌等调节人体机能（邓丽红等，2017）的作用和极强的繁殖能力。随着科学技术的飞速发展，人们对苦菜药用价值的研究更加深入（高治国等，2017）。通过研究表明，苦菜提取液其抑制强弱顺序为细菌、霉菌、酵母菌，对不同菌种均有明显的抑制作用（侯金丽等，2015）。苦菜根、茎、叶的乙醇提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有一定的抑制作用（郭爱华等，2016）。石磊等（2018）通过研究阐述了不同提取方法对苦菜浸提液可溶性固形物含量的影响。而苦菜中所含有的硒也是人体所必需的微量元素，其形成了许多活性蛋白质，可以保护机体不受由自由基引起的氧化性损伤。近年来，硒在不同食物来源的生物利用度己经通过使用各种体外肠消化过程的生物可接近性进行了评估（王晓雅，2006）。梁潘霞（2016）对植被硒蛋白不同提取方法进行了详细的阐述，之后又通过试验优化工艺使硒蛋白提取率得到提高（梁潘霞等，2017）。目前有研究发现，恩施碎米荠的碱溶蛋白质中硒结合蛋白含量最高（曹斌等，2016）。对茶叶硒蛋白的研究表明，不同溶剂提取的茶叶硒蛋白均具有较强的抗氧化活性（程利增，2017）。而作为全球最大的饲料生产国，我国饲料行业快速发展，已由以量为主转变为高质量发展阶段，因此研究苦菜硒蛋白的饲料添加剂有着举足轻重的作用。

本试验通过参考国内外富硒饲料添加剂的研究，利用超声波辅助提取技术对苦菜中硒蛋白的提取工艺进行研究，分析各单因素对其提取工艺的影响。在单因素试验的基础上，对响应面进行优化试验验，再由Design-Expert 8.0软件确定提取硒蛋白的最佳工艺，将提取得到的硒蛋白从DPPH自由基清除能力和还原力这两方面分析其抗氧化性，以期为苦菜硒蛋白饲料添加剂在动物养殖业的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 苦菜，产于福建南平的野生苦菜；考马斯亮蓝，天津光复试剂有限公司；NaOH，天津风船化学试剂厂；无水乙醇，天津凯通化学试剂厂；DPPH溶液，福州飞净生物科技有限公司；维生素C，山东科德化工有限公司。

1.2 试验仪器 UV-3100PC紫外可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司；HH-1数显恒温水浴锅，金坛新瑞仪器厂；GZX-9146MBE电热鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司；SHB-III循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；BSA224S分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；F-020SF-020S超声波清洗，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 苦菜硒蛋白制备的工艺流程 原料选择→预处理→称样品→粉碎→过筛→超声波辅助提取→过滤→测定；操作要点：挑选新鲜苦菜洗净，于87℃烘干至恒重，粉碎后过80目筛，得样品苦菜粗粉。称取1 g样品，加入0.3 mol/L NaOH溶液，在超声波时间16 min，料液比1∶30 g/mL，超声波功率78 W的条件下超声波辅助提取苦菜硒蛋白，过滤，吸取样液1 mL，稀释30倍，吸取稀释后的样液0.05 mL，加入5 mL的考马斯亮蓝，混匀后于分光光度计595 nm处测吸光度（郝涤非等，2018）。

1.4 苦菜硒蛋白提取的单因素试验

1.4.1 NaOH浓度对硒蛋白提取量的影响 分别选择NaOH浓度0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mol/L，在超声波时间16 min，料液比1∶30 g/mL，超声波功率78 W的条件下提取苦菜硒蛋白。过滤，稀释样液30倍，取0.05 mL的样液，加入考马斯亮蓝5 mL，混匀，待测。

1.4.2 超声波时间对硒蛋白提取量的影响 超声波时间分别取10、12、14、16、18 min和20 min，在料液比1∶30 g/mL，NaOH浓度0.3 mol/L，超声波功率78 W条件下提取苦菜硒蛋白。过滤，稀释样液30倍，取0.05 mL的样液，加入考马斯亮蓝5 mL，混匀，待测。

1.4.3 料液比对硒蛋白提取量的影响 料液比分别取1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL和1∶35 g/mL，在超声波时间16 min，超声波功率78 W，NaOH浓度0.3 mol/L条件下提取苦菜硒蛋白。过滤，稀释样液30倍，取0.05 mL的样液，加入考马斯亮蓝5 mL，混匀，待测。

1.4.4 超声波功率对硒蛋白提取量的影响 超声波功率分别取58、68、78、88 W和98 W，在超声波时间16 min，NaOH浓度0.3 mol/L，料液比1∶30 g/mL条件下提取苦菜硒蛋白。过滤，稀释样液30倍，取0.05 mL的样液，加入考马斯亮蓝5 mL，混匀，待测。

1.5 苦菜硒蛋白提取的响应面优化试验 在单因素提取苦菜硒蛋白试验的基础上，对其中四个因素进行响应面试验，优化苦菜硒蛋白提取量，通过Design-Expert 8.0软件，分析苦菜硒蛋白提取量的最佳工艺方案，然后将得到的最佳试验数据，进行试验检验（郭爱华等，2020；刘楠，2016）。响应面分析试验因素与水平设计见表1。

表1 苦菜硒蛋白提取响应面试验的因素及水平

1.6 苦菜硒蛋白的抗氧化性分析

1.6.1 DPPH自由基清除能力 将提取得到的苦菜硒蛋白和维生素C配成系列浓度为0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL的样品溶液，取各浓度样品溶液2 mL分别置于试管中，加入0.1 mol/L无水乙醇配制的DPPH溶液2 mL，轻微振荡混匀，室温下暗处静置30 min后在517 nm波长处测吸光值。A空白组为2 mL样品液加入2 mL无水乙醇，A对照组为2 mL蒸馏水加入2 mL DPPH溶液（郑翠萍等，2016；谢三都等，2015）。根据下列公式计算自由基清除率。

1.6.2 还原力的测定 将提取得到的苦菜硒蛋白和维生素C配成系列浓度为0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL的样品溶液，取各浓度样品溶液1 mL分别加入试管中，然后依次加入1 mL 0.2 mol/L、pH 6.0的PBS、1 mL 1%铁氰化钾，在50℃下水浴20 min，迅速冷却后，加入1 mL浓度为10%的三氯乙酸，0.2 mL 0.1%氯化铁,轻微振荡混匀10 min后在700 nm波长处测吸光值。吸光值越大,说明总还原能力越强。

2 结果与分析

2.1 苦菜硒蛋白提取的单因素试验

2.1.1 NaOH浓度对苦菜硒蛋白提取量的影响由图1可知，当NaOH浓度为0.1～0.2 mol/L时，硒蛋白的提取量随着NaOH浓度的增加而上升；当NaOH浓度为0.20～0.3 mol/L时，硒蛋白的提取量随着NaOH浓度的增加而下降；当NaOH浓度为0.20 mol/L时，苦菜硒蛋白的提取达到最佳值。因此，选取NaOH浓度为0.2 mol/L。

图1 NaOH浓度对苦菜硒蛋白提取量的影响

2.1.2 超声波时间对苦菜硒蛋白提取量的影响由图2可知，当超声波提取时间为10～14 min时，硒蛋白的提取量随着超声波时间的增加而上升；当超声波提取时间为14～18 min时，硒蛋白的提取量随着超声波提取时间的增加而下降；当超声波提取时间为14 min时，苦菜硒蛋白的提取量达到最佳值。因此，选取超声波提取时间为14 min。

图2 超声提取时间对苦菜硒蛋白质提取量的影响

2.1.3 料液比对苦菜硒蛋白提取量的影响 由图3可知，当料液比为1∶15～1∶25 g/mL时，硒蛋白提取量随着料液比的增加而上升；当料液比为1∶25～1∶35 g/mL时，硒蛋白提取量随着料液比的增加而下降；当料液比为1∶25 g/mL时，苦菜硒蛋白提取量达到最佳值。因此，选取料液比为1∶25 g/mL。

图3 料液比对苦菜硒蛋白提取量的影响

2.1.4 超声波功率对苦菜硒蛋白提取量的影响由图4可知，当超声波功率为58～78 W时，硒蛋白提取量随着超声波功率的增加而上升；当超声波功率为78～98 W时，硒蛋白提取量随着超声波功率的增加而下降；当超声波功率为78 W时，苦菜硒蛋白提取量达到最佳值。因此，选取超声波功率为78 W。

图4 超声提取功率对苦菜硒蛋白提取量的影响

2.2 苦菜硒蛋白提取响应面试验结果

2.2.1苦菜硒蛋白提取试验结果 综合单因素试验结果，选取NaOH浓度、料液比、超声波功率及超声波时间为考察因素，根据响应面分析法中心组合设计原理进行响应面试验，苦菜硒蛋白提取的响应面试验结果见表2。

表2 苦菜硒蛋白提取试验结果

2.2.2 响应面试验回归模型的建立 利用Design-Expert 8.0.6软件对响应面试验结果进行多元回归分析，得到苦菜硒蛋白提取量与NaOH浓度A、料液比B、超声波功率C、超声波时间D的二次回归模型为：Y=2.51+7.333E-003A+0.017B-0.018C-0.070D+2.000E-003AB-0.015AC+0.032AD-4.750E-003BC-0.10BD+0.060CD-0.39A2-0.30B2-0.32C2-0.25D2。

对回归模型进行方差分析（表3），可以看出模型P＜0.0001，具有极显著性，失拟项P=0.1694（P＞0.05），即方程模型失拟项不显著，R2=0.9973说明回归模型与预测值之间具有良好的拟合度，R2adj=0.9947，表明模型拟合度较好，可用于预测苦菜硒蛋白提取量的最佳情况，NaOH浓度、料液比、超声波功率、超声时间与苦菜硒蛋白提取量之间的线性关系显著。因此可以用此模型对试验结果进行分析和预测。由表3可以看出看出，在试验所选各因素水平范围内B、C、D的P值均小于0.01，对模型影响极其显著；二次项A2、B2、C2、和D2的P值均小于0.0001，对模型影响极其显著；交互项AB、AC、BC的P值均大于0.05，说明它们的影响不显著；交互项AD、BD、CD的P值均小于0.01，说明它们的影响极其显著。所以由以上分析得出对苦菜硒蛋白提取量影响的主要顺序为：超声波时间＞超声波功率＞料液比＞NaOH浓度。

表3 苦菜硒蛋白回归方程系数显著性检验

2.2.3 响应面曲面分析 苦菜硒蛋白提取量影响的大小程度取决于响应面曲面的坡度。等高线图的形状表明变量间的交互作用是否显著，椭圆等高线表明变量间的交互作用显著，圆形等高线表明交互作用不显著。

由图5可知，当NaOH浓度为0.20 mol/L、料液比为125.26 g/mL时苦菜硒蛋白提取量最高。NaOH浓度相对于料液比来说对苦菜硒蛋白提取量的影响不太显著。由等高线分析可知当NaOH浓度不变时，沿着料液比变化的方向看料液比与NaOH浓度等高线呈圆形。说明NaOH浓度与料液比的交互作用对苦菜硒蛋白提取量的影响不显著。

图5 NaOH浓度与料液比的响应面与等高线

由图6可知，当NaOH浓度为0.20 mol/L、超声波功率为77.16 W时苦菜硒蛋白提取量最高。NaOH浓度相对于超声波功率来说对苦菜硒蛋白提取量的影响不太显著。由等高线分析可知当NaOH浓度不变时，沿着料液比变化的方向看超声波功率与NaOH浓度等高线呈圆形。说明NaOH浓度与超声波功率的交互作用对苦菜硒蛋白提取量的影响不显著。

图6 NaOH浓度与超声波功率的响应面与等高线

由图7可知，当NaOH浓度为0.20 mol/L、超声波时间为13.37 min时苦菜硒蛋白提取量最高。NaOH浓度相对于超声波时间来说对苦菜硒蛋白提取量的影响不太显著。由等高线分析可知当NaOH浓度不变时，沿着超声波时间变化的方向看超声波时间等高线密集。说明超声波时间对苦菜硒蛋白提取量的影响显著。

图7 NaOH浓度与超声波时间的响应面与等高线

由图8可知，当料液比为1∶25.26 g/mL、超声波功率为77.16 W时苦菜硒蛋白提取量最高。料液比相对于超声波功率来说对苦菜硒蛋白提取量的影响不太显著。由等高线分析可知当料液比不变时，沿着超声波功率变化的方向看超声波功率与料液比等高线呈圆形。说明超声波功率与料液比的交互作用对苦菜硒蛋白提取量的影响不显著。

图8 料液比与超声波功率的响应面与等高线

由图9可知，当料液比为1∶25.26 g/mL、超声波时间为13.37 min时苦菜硒蛋白提取量最高。料液比相对于超声波时间来说对苦菜硒蛋白提取量的影响不太显著。由等高线分析可知当料液比不变时，沿着超声波时间变化的方向看超声波时间等高线密集。说明超声波时间对苦菜硒蛋白提取量的影响显著。

图9 料液比与超声波时间的响应面与等高线

由图10可知，当超声波功率为77.16 W、超声波时间为13.37 min时苦菜硒蛋白提取量最高。超声波功率相对于超声波时间来说对苦菜硒蛋白提取量的影响不太显著。由等高线分析可知超声波功率不变时，沿着超声波时间变化的方向看超声波时间等高线密集。说明超声波时间对苦菜硒蛋白提取量的影响显著。

图10 超声波功率与超声波时间的响应面与等高线

2.2.4 最佳苦菜硒蛋白提取结果验证 由响应面软件对工艺条件进行优化，分析得苦菜硒蛋白提取量的最佳试验条件为：NaOH浓度0.20 mol/L，料液比1∶25.26 g/mL，超声波功率77.16 W，超声波时间13.37 min，在此条件下的提取量为2.519 mg/g。根据优化提取条件的试验结果，为了之后的方便操作，将苦菜硒蛋白的提取工艺条件调整为：NaOH浓度0.2 mol/L，料液比1∶25 g/mL，超声波功率78 W，超声波时间14 min。在根据优化提取后的条件下，进行3次的平行实验，得到苦菜硒蛋白的提取量为2.595 mg/g，与预测值相接近。

2.3 苦菜硒蛋白的抗氧化性分析

2.3.1 总还原力的检测 由图11可知，苦菜硒蛋白总还原能力，能够表明抗氧化物供电子的能力，试验中配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，5个梯度的苦菜硒蛋白，并且评价其总还原力。从图11中可知，苦菜硒蛋白在试验浓度范围内和维生素C一样随着浓度的升高总还原能力增强，但是始终低于维生素C的总还原能力。当苦菜硒蛋白浓度达到2.5 mg/mL时，总还原能力基本趋于稳定。

图11 苦菜硒蛋白的总还原力

2.3.2 对DPPH的清除作用 由图12可知，与维生素C相比较，苦菜硒蛋白对DPPH的清除作用较强，随着苦菜硒蛋白浓度的增加清除作用不断增强，在质量浓度0.1 mg/mL时,其DPPH的清除率可达到63.2%，说明苦菜硒蛋白对DPPH有很好的清除作用。

图12 苦菜硒蛋白不同浓度下的DPPH清除试验

3 结论

在超声波提取苦菜硒蛋白的基础上，响应面优化NaOH浓度、料液比、超声波功率、超声波时间这四个因素，得到提取硒蛋白的最佳工艺条件为：NaOH浓度0.2 mol/L，料液比1∶25 g/mL，超声波功率78 W，超声波时间14 min，得到苦菜硒蛋白提取量为2.595 mg/g。通过对苦菜硒蛋白抗氧化性分析得知，在浓度为0.1 mg/mL时，苦菜硒蛋白对DPPH的清除率可达到63.2%；而苦菜硒蛋白的总还原能力的结果表明，苦菜硒蛋白的总还原能力随着浓度的增加而增加。超声波辅助提取法具有提取率高、操作简单等优点，有效地提高了苦菜硒蛋白的提取量和提取产物的抗氧化能力，有良好的发展前景。