富含抗菌脂肽的微生态制剂制备及应用效果研究

杜秀园，朱锋钊，陈 敏，邬小兰，刘彦彦，胡美忠

（铜仁职业技术学院，贵州铜仁 554300）

畜禽产品是人类饮食结构中重要的蛋白质来源，然而在畜禽生产过程中，为了提升经济效益，存在抗生素不规范使用、促生长类激素滥用、兽药大量应用导致残留等问题，极大地影响了食品安全。因此，2020年7月1日，国家出台了相关政策法规，禁止在饲料添加剂中使用抗生素，故寻找绿色、安全、可靠的新制剂是当前畜禽养殖业亟待解决的现实问题（金尔光等，2017）。

抗菌脂肽是芽孢杆菌的次级代谢产物，在医药、食品、农业等方面有广阔的应用前景（张嫚等，2004）。近年来，以抗菌脂肽作为保健制剂应用于畜禽生产并取得了良好应用效果的报道屡见不鲜。研究表明，抗菌脂肽在促进动物生长、提高饲料利用率、提高胴体品质等方面有着积极的作用（朱文斌，2021）。亦有研究表明，将抗菌脂肽和芽孢杆菌等益生菌配伍应用，可在动物体内发挥良好的协同作用，实现提高养殖动物的生长性能、机体免疫力和饲料转化率，达到替代抗生素和促生长类激素，从而减少兽药使用，保障食品安全的目的。鉴于此，本试验拟通过研究Bacillus subtilis S21固态发酵工艺，获得以较低成本生产富含抗菌脂肽的微生态制剂的工艺，并对其应用效果进行初步考察。

1 试验材料

1.1 主要培养基质 豆粕、黄豆、玉米碴，均为本地市场采购。

1.2 菌种与培养基 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S21，由本实验室筛选自铜仁市菜园土壤，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏编号为：CGMCC No:15544。所用培养基为LB培养基。

1.3 主要仪器 台式高速冷冻离心机（型号为EXPE R T15K-R），由湖南吉尔森科技发展有限公司生产；恒温培养箱（型号为BPH-9042），由上海一恒科学仪器有限公司生产；高压灭菌锅（型号为HVE-50）；电热鼓风干燥箱（型号为XT5118LOV240），由杭州雪中炭恒温技术有限公司生产；安捷伦1100型高效液相色谱仪，由安捷伦科技有限公司生产。

2 试验方法

2.1 固态发酵不同培养基质加水量的筛选 选取玉米碴、黄豆、豆粕作为主要培养基质，分别按料液比（g/mL）为1:0.5，1:1，1:1.5加入水（1 L水含蔗糖30 g，硫酸镁0.5 g，氯化钾0.1 g，磷酸二氢钾0.2 g，硫酸锰0.1 mg，硫酸铜0.03 mg，硫酸铁0.03 mg），混匀放置12 h，蒸锅蒸1 h后冷却至室温，按培养基质重量的10%（g/mL）接种菌液，37℃培养72 h，干燥至含水量低于10%，取干燥样品约5.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇至总体积为50 mL，超声10 min，过滤，测定干燥发酵样品中抗菌脂肽的含量。

2.2 培养基质和培养条件的筛选 分别以玉米碴、黄豆、豆粕为主要培养基质考察对象，按料液比1:1加入水，考察氧气、蔗糖、培养温度、培养时间对抗菌脂肽产量的影响，具体设计见表1。发酵完毕的样品处理同2.1，然后测定样品中抗菌脂肽的含量。

表1 抗菌脂肽微生态制剂培养基质和培养条件筛选

2.3 富含抗菌脂肽微生态制剂的制备工艺 通过筛选确定培养基为豆粕：水=1:1（1 L水含蔗糖30 g，硫酸镁0.5 g，氯化钾0.1 g，磷酸二氢钾0.2 g，硫酸锰0.1 mg，硫酸铜0.03 mg，硫酸铁0.03 mg），基质配制完成放置12 h，后置于多层大型蒸锅中，每层厚度为3～5 cm，加热蒸煮1 h，冷却后接种，打开蒸锅顶层透气孔及下面透气孔，使空气形成对流，控制蒸锅下面加热器，使温度维持在30℃左右，培养60 h后，置于电热鼓风干燥箱中，干燥温度为50℃，烘干至含水量＜10%，粉碎至能100%通过40目筛，且95%以上能通过60目筛。封口袋包装，避光处保存。并对发酵产品进行抗菌脂肽含量及芽孢数检测。

2.4 抗菌脂肽含量和孢子数的测定

2.4.1 抗菌脂肽测定方法 采用HPLC法进行抗菌脂肽含量测定（陈敏等，2021）。色谱条件：色谱柱为5TC-C18柱，检测波长210 nm，柱温30℃，流速为1 mL/min，进样量20μmol，流动相为90%乙腈（有机相和水相中均加入0.1%的三氟乙酸）。标准曲线的绘制：取抗菌脂肽（sigma）标准品，精密称定，分别配制成浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的溶液，取上述各溶液分别进样测定，绘制标准曲线。得到抗菌脂肽标准品峰面积与浓度（mg/mL）的关系函数为：Y=6920.7X+404.36，R2=0.9976（Y为峰面积，X为浓度）。样品的检测：取自制微生态制剂约5 g，精密称定，加入甲醇10 mL，密塞，超声10 min，离心（8000 r/min）10 min，取甲醇上清液，将上清液按照上述HPLC定量检测方法测定其中抗菌脂肽含量，重复测定3次取平均值。

2.4.2 孢子数测定方法 采用平板菌落计数法，具体参照GB/T 26428（饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测）方法进行。

2.5 养殖应用试验

2.5.1 试验设计及饲养管理 选取本地品种青脚土鸡苗100只，随机分成5组，1～4组分别在基础日粮中添加0.20%、0.30%、0.40%、0.50%的自制微生态制剂，5组（对照组）饲喂基础日粮，每组设置5个重复，每个重复4只。早晚各饲喂1次，自由采食，定期清理粪便，保障鸡舍内卫生，饲养员每日巡视鸡舍，挑出死亡鸡只，计算死亡率。分别于供食鸡苗20、35、50日龄对各试验组进行空腹称重，且每日记录每组给料量和剩料量，计算平均日采食量及料重比。

2.5.2 基础日粮组成 参考本地土鸡饲养的日粮组成配制基础日粮，日粮组成及营养水平见表2。

表2 雏鸡基础日粮组成及营养水平

3 结果与分析

3.1 加水量对固态发酵的影响 固态发酵需要控制好加水量，水量少不利于发酵剂菌种生长，水量过多不利于干燥，且对于需氧菌，不利于通气。本试验分别以豆粕、黄豆、玉米渣为培养基质，不同加水量对发酵和抗菌脂肽产量的影响见表3。

从表3可以看出，以豆粕和黄豆为培养基质，其与水的最佳比例为1:1，此时含水量适宜，培养基质湿润、透气性较好，菌生长良好，能获得较高的抗菌脂肽发酵产量，且后期干燥耗能较低。而以玉米碴为培养基质，其与水的最佳比例为1:0.5，但以玉米碴为培养基质，抗菌脂肽发酵产量较低。故将培养基质与水的比例确定为1:1。

表3 加水量对发酵和抗菌脂肽含量的影响

3.2 培养基质和培养条件对抗菌脂肽产量的影响 不同培养基质、不同培养条件对抗菌脂肽产量的影响结果见表4（仅对有氧并有蔗糖的培养条件下抗菌脂肽的含量进行了方差分析）。

从表4可知，氧气对抗菌脂肽产量影响较大，无氧条件下，很难发酵产生抗菌脂肽；温度方面，30℃相对于室温，更有利于抗菌脂肽产生，其中以豆粕和黄豆为培养基质，在30℃有氧条件下，抗菌脂肽含量都超过了600 mg/kg；蔗糖作为碳源，对菌种的代谢也很重要，缺乏蔗糖，不利于发酵产生抗菌脂肽；培养时间方面，除豆粕和黄豆在室温条件下，发酵60 h与72 h比较存在极显著差异（同行数据比较，P＜0.01）；其余组别在其他条件一致的情况下（有氧，添加蔗糖，发酵温度相同），发酵60 h与72 h相比抗菌脂肽的产量没有显著性差异（同行数据比较，P＞0.05），但与发酵48 h相比，抗菌脂肽的产量有极显著提高（同行数据比较，P＜0.01），出于节能和高效的考虑，选择培养时间为60 h。培养基质方面，三种培养基质中，玉米碴在各种培养条件下的抗菌脂肽产量均低于豆粕和黄豆。比较以豆粕和黄豆作为培养基质，在有氧、添加蔗糖、30℃条件下，培养相同时间，抗菌脂肽产量没有显著性差异（同列数据比较，P＞0.05），从成本角度出发，选择豆粕作为主要培养基质。

表4 几种不同培养基质在不同条件下的抗菌脂肽发酵产量

3.3 富含抗菌脂肽微生态制剂的制备 按照2.3所述制备方法，一次可生产富含抗菌脂肽的微生态制剂产品20 kg，对关键指标抗菌脂肽进行检测发现，其含量在400～600 mg/kg，与小批量生产相比，抗菌脂肽产量略有下降。根据GB/T 26428（饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测）方法，对上述产品进行芽孢数检测，其6个月后芽孢数仍大于1×109cfu/g。

3.4 养殖应用试验结果3.4.1 雏鸡日增重测定结果 由表5可知，20～35日龄日均增重1～4组与5组（对照组）之间有显著差异（P＜0.05），1组与3组、4组之间无显著性差异（P＞0.05）；试验1、2、3、4组较对照组分别提高了56.59%、56.77%、38.96%、35.62%；35～50日龄日均增重1～4组与5组（对照组）之间有显著差异（P＜0.05），1组与2组、4组之间无显著性差异（P＞0.05）；试验1、2、3、4组较对照组分别提高了43.10%、43.57%、63.17%、46.24%。

表5 雏鸡日增重测定结果g

3.4.2 雏鸡死亡率和料重比测定结果 由表6可知，整个试验期间，对照组雏鸡死亡率最高，为20.00%，1～4组死亡率均低于对照组，其中3组和4组无死亡鸡只。料重比方面，1～4组显著低于对照组（P＜0.05）；20～35 d，试验1、2、3、4组较对照组分别降低了19.25%、24.88%、14.08%、13.61%；35～30 d，试验1、2、3、4组较对照组分别降低了9.38%、9.82%、18.30%、9.38%。

表6 雏鸡死亡率和料重比测定结果

4 讨论与结论

由于豆粕中含有大量的蛋白质、脂肪等营养物质，使其成为了动物养殖中蛋白质资源的首选（胡瑞等，2013）。但由于其成分特点，如氨基酸含量不平衡、存在多种抗营养因子等，使其不易被完全消化，且豆粕质地结构较致密、硬度高，导致其适口性较差，这些因素降低了其的应用价值。而利用发酵技术，可使其在发酵过程中产生多种风味物质，且质地由致密变得较蓬松，从而提高其适口性，促进动物采食（刘星等，2020）。并且通过微生物发酵技术生产的高质量发酵豆粕中，大分子蛋白质被分解为小肽分子，小肽具有吸收耗能低，吸收速率快，不易饱和等特点，使发酵后豆粕的营养价值大幅度提高（李莹等，2019）。发酵还可产生蛋白酶、非淀粉多糖酶和植酸酶等多种生物活性物质 （辛娜等，2020），对于动物更好的消化吸收营养物质，起到积极的作用。

枯草芽孢杆菌是一种在饲料添加剂发酵中常用的菌株，属于革兰氏阳性菌，在动物饲料中以芽孢的形式存在，可防止其在加工过程中被破坏，它同时也是一种常见的益生菌，动物食用添加了该菌种的饲料后，可调节肠道微生物菌群平衡，同时还可以提高动物的免疫力，促进生长发育（宋立立等，2014）。欧荣娣等（2014）利用枯草芽孢杆菌固态发酵米糠，将其拌入日粮中饲喂临武鸭，试验结果表明，与对照组相比，日料中添加枯草芽孢杆菌可有效提高临武鸭日均增重，降低料重比和死亡率。李卫芬等（2011）研究了枯草芽孢杆菌对肉鸡生长性能的影响，结果表明，在基础日粮中添加0.75 g/kg的枯草芽孢杆菌制剂，肉鸡的日增重显著高于饲喂基础日粮组。

固态发酵是指在有一定湿度的水不溶性固态基质中，用一种或多种微生物进行发酵的生物反应过程（王永伟等，2019；李卫芬等，2011）。由于其具有操作简便、耗能较低、条件不严苛以及有利于微生物生长繁殖等优势，使其在发酵领域有广泛的应用，而且很适合枯草芽孢杆菌这种需氧菌的发酵。固态发酵氧气充足，可使枯草芽孢杆菌生长旺盛，并产生淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶等多种生物酶，从而使原料中的淀粉、蛋白质、纤维素等大分子物质转化为小分子营养物质（刘桂香等，2016），以利于动物吸收。

本研究使用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）S21作为发酵剂，采用固态发酵的方式发酵豆粕。其试验研究表明，以蔗糖为碳源，加入微量无机盐，接种量为10%，发酵温度为30℃，采用固态发酵方式，发酵60 h，实现了以较低成本生产富含抗菌脂肽的微生态制剂的目的，发酵产物抗菌脂肽含量≥0.4 mg/g，且芽孢数＞1×109cfu/g。试验数据显示，本产品提高了豆粕中营养成分在动物体内的吸收利用率，改善了口感口味，应用本产品后能够达到降低料重比，改善雏鸡生长性能、促肥增长的效果，且由于其富含抗菌脂肽和芽孢，二者的协同作用具有增强免疫力的效果，应用后降低了雏鸡死亡率，从而降低养殖成本，提高经济效益。