抗奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌-细菌素的筛选及特性研究

涂会鑫，董文龙，孟雨晴，张 涵，徐菁岐

（吉林农业科技学院 动物科技学院，吉林吉林 132109）

奶牛乳房炎是一类严重危害奶牛养殖业的常发疾病，给世界奶牛养殖业造成了严重的经济损失。其中细菌性乳房炎可造成奶牛产奶量下降，牛奶品质降低，严重时可导致生产性能丧失（张倩等，2017）。研究表明，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）诱发的奶牛乳房炎，在某些奶牛场感染率达50%以上（Bannerman等，2008）。目前国内外预防和治疗奶牛乳房炎大多使用抗生素，抗生素滥用导致临床致病株耐药性不断增强。奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌耐药菌株数显著增加，其耐药性也不断增强（刘肖利等，2021）。尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）流行株逐年增多，常诱发慢性和复发性奶牛乳房炎，使临床治疗更加困难。其中ST9作为我国MRSA中最常见的分子分型，已在中国香港、浙江和上海的牛源MRSA中检出（Boost等，2013）。孟丹（2018）和Yi（2018）研究发现，新疆奶牛养殖业流行的临床型奶牛乳房炎MRSA表现为多重耐药，并从牛乳中分离到人源性ST188，ST9。此外Zhou（2017）和Li（2017）研究发现，我国上海、江苏、浙江等地区检出ST630的奶牛源MRSA菌株。因此研发新型替抗产品用于奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的防治已迫在眉睫。

乳酸菌在自然界中广泛存在，是人和动物肠道中的有益微生物。乳酸菌能够发酵原料中的糖生成乳酸、过氧化氢、细菌素和其他有机酸等产物，这些物质特别是细菌素可有效抑制某些病原菌的生长（王利君等，2020）。细菌素（bacteriocin）是由一部分革兰氏阳性菌和阴性菌在生长代谢过程中通过核糖体合成并分泌到环境中的一类具有抑菌活性的蛋白类物质，具有高效、安全、无毒、无残留等特点，在新型天然抑菌剂研究与开发中有着巨大应用潜力，可作为代替抗生素的新型抗菌药物（Gálvez等，2007）。

为此本研究以金黄色葡萄球菌为指示菌，从奶酪样品中分离到一株产细菌素乳杆菌（LS-1），并进一步研究其细菌素的生物学特性，为开发一种新型天然替抗药物防治金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 菌株LS-1由内蒙古手工奶酪中分离获得。金黄色葡萄球菌（S.aureus）ATCC25923、大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC25922、化脓隐秘杆菌（Trueperella pyogenes）ATCC19411。金黄色葡萄球菌S1、金黄色葡萄球菌S2，大肠杆菌E1、大肠杆菌E2，化脓隐秘杆菌T1、化脓隐秘杆菌T2，均为奶牛源临床分离株，由吉林农业科技学院动物科技学院动物微生物与免疫研究室保存。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的分离培养 用无菌镊子取适量奶酪于MRS琼脂培养基，涂布均匀，37℃恒温培养箱静置培养24 h。平板挑取不同菌落于MRS琼脂培养基划线纯化，直至镜检观察得到形态相同的菌体。挑起单个菌落接种于MRS液体培养基，37℃恒温增殖培养18 h，-80℃甘油保存。

1.2.2 拮抗菌株的初筛 将分离活化后的菌株按照1：300的比例接种于300 mL的LB液体培养基，37℃条件下振荡培养24 h。取出发酵液，3500 r/min离心45 min，使用0.22μm滤膜，真空泵抽滤除菌，初步得到发酵上清液，再放入旋转蒸发仪中浓缩至30 mL得到发酵上清浓缩液。采用琼脂扩散法测定各菌株无菌上清浓缩液的抑菌活性：将金黄色葡萄球菌ATCC25923的菌液浓度调整为1×108cfu/mL左右，在MH琼脂培养基上均匀涂布后打孔（直径约为8 mm），每孔加入200μL除菌上清浓缩液，室温静置1 h，37℃恒温培养24 h。测量抑菌圈直径，筛选出产抗菌物质菌株。

1.2.3 拮抗菌株的复筛 将活性菌株无菌上清浓缩液分成三组，第一组加入过氧化氢酶至终浓度为1 mg/mL，37℃水浴2 h，然后沸水浴煮5 min；第二组配制与无菌上清浓缩液具有相同pH的乳酸；第三组不做任何处理作为对照组。采用上述琼脂扩散法将各组处理样品加入孔洞中，静置1 h，37℃恒温培养24 h。除去因产生过氧化氢和酸性物质起到抑菌作用的菌株。

1.2.4 LS-1的菌落、菌体形态 将菌株接种MRS琼脂培养基中，37℃恒温培养24 h。挑取单个菌落，滴加一滴生理盐水于载玻片上稀释，酒精灯火焰上加热固定，按照革兰氏染色试剂盒说明书进行革兰氏染色，显微镜下观察菌体形态。

1.2.5 LS-1的16SrRNA鉴定 用DNA提取试剂盒提取LS-1的基因组，以提取的DNA模板对LS-1的16SrRNA片段进行扩增。通用引物如下（Moreno 等，2002）：16S rRNA -F：5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，16SrRNA-R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到长度正确的PCR产物，合格样品送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，将测序所获得的16S rRNA序列与NCBI数据库进行同源比对。

1.2.6 LS-1细菌素生物学特性测定

1.2.6.1 酶对细菌素的影响 将发酵上清浓缩液分为4份，加入2 mg/mL蛋白酶（胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶）。胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶置于37℃水浴，木瓜蛋白酶60℃水浴，4 h后100℃加热5 min终止反应（Zhu等，2014）。以发酵上清浓缩液为对照组，进行抑菌试验。方法同上。

1.2.6.2 温度对细菌素的影响 将发酵上清浓缩液分为4份，于40、60、80℃水浴2 h，100℃水浴10 min，以发酵上清浓缩液为对照组，进行抑菌试验。方法同上。

1.2.6.3 pH对细菌素的影响 用1 mol/L的乳酸、1 mol/L氢氧化钠分别将发酵上清浓缩液的pH调至4.0、7.0、9.0、11.0，室温静置1 h后pH调回至5.0，以发酵上清浓缩液为对照组，进行抑菌试验。方法同上。

1.2.6.4 抑菌谱的测定 取-80℃所储存指示菌（9株）复苏活化，接种到适宜液体培养基，于37℃恒温培养24 h。采用平板计数法将菌液浓度调整为1×108cfu/mL左右，使用琼脂扩散法进行抑菌试验，并记录抑菌圈直径。

以上所有抑菌试验均进行3次，测量抑菌圈直径，取其平均值。

2 结果

2.1 产细菌素菌株的筛选 通过琼脂扩散法筛选到一株产细菌素菌株LS-1（图1），经复筛排除过氧化氢、有机酸的影响。发酵液经过过氧化氢酶处理后，抑菌圈直径大小不变，说明菌株的抑菌活性与过氧化氢无关。与发酵液具有相同pH的乳酸产生的抑菌圈直径变小，说明发酵液产生的乳酸具有一定的抑菌作用，但起不到决定作用。因此可以初步判定LS-1具有抗菌作用主要是因为细菌素。

图1 LS-1发酵液对金黄色葡萄球菌ATCC25923的抑菌效果

2.2 产细菌素菌株的鉴定

2.2.1 LS-1的分离培养及镜检结果 菌株LS-1在MRS固体培养基上划线37℃培养24 h，观察可见其表面乳白光滑、圆形突起、边缘整齐（图2）。将单菌落革兰氏染色，油镜下观察菌体为阳性短杆、无芽孢（图3）。

图2 LS-1菌落形态

图3 LS-1的革兰氏染色镜检图（1000×）

2.2.2 LS-1的16SrRNA鉴定 通过16S rRNA基因引物，PCR扩增菌株LS-1的16S rRNA片段，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可得到一条位于1500 bp左右的条带（图4）。测序结果与NCBI数据库进行序列比对，该菌株与Lacticaseibacillus saniviri（L.saniviri）同源性为98.71%。

图4 16S rRNA基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳

2.2.3 细菌素稳定性的测定 发酵液经过木瓜蛋白酶、胃蛋白酶处理后失去抑菌活性，由此推断LS-1的发酵液中的抑菌成分是一种细菌素（表1）。LS-1的细菌素具有良好热稳定性。发酵液经过不同温度处理后，抑菌效果有所下降，但是抑菌活性依旧接近80%（抑菌活性=试验组抑菌圈/对照组抑菌圈×100%）。LS-1的细菌素具有较好的酸碱稳定性。细菌素在pH为4.0、7.0、9.0时保持良好抑菌活性，且抑菌活性不低于70%，pH＞9.0时抑菌活性消失（表1）。

表1 蛋白酶、温度、酸碱对LS-1的细菌素活性影响

2.2.4 抑菌谱的测定 LS-1的细菌素对奶牛乳房炎主要病原菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、化脓隐秘杆菌）均有不同程度的抑菌作用。LS-1细菌素对金黄色葡萄球菌标准株、奶牛源临床分离株的抑菌作用最好，抑菌圈＞30 mm（表2）。整体而言，LS-1细菌素具有较高的抑菌活性。

表2 LS-1细菌素的抑菌谱

3 讨论

近年来，在世界各国的奶牛业疫病中，金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎的防治问题十分突出，也是我国奶牛业中具有重大经济学意义的疾病。金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎常常诱发乳房出血，溶血素是该菌一种重要的致病因子，其中α溶血素对人类有致病作用（魏志恒等，2009）。目前奶牛场常用防治和治疗措施仍然是使用抗生素，而金黄色葡萄球菌极易产生针对常用抗生素的耐药性，多重耐药性MRSA的出现使奶牛乳房炎很难治愈（庞盛林，2014）。

耐药性是所有抗菌性药物必然会遇到的问题，细菌素与抗生素一样也会有耐药性菌株的出现，但其出现的概率在1×10-9～1×10-8，比抗生素的概率要低得多（Guinane等，2010）。研究表明，产细菌素菌株在自然界中普遍存在，30%～99%的细菌和古生菌可以产生至少一种细菌素（Gao等，2022）。此外，细菌素对多种蛋白酶敏感，不易残留或产生抗药性，安全性高。另外细菌素对高温、酸性的耐受能力强，可用于开发抗生素类、激素类的替代药品（Riley等，2007）。其中乳酸菌细菌素在安全性、抑菌性等其他活性研究方面逐渐被认识，并成为蛋白质研究的一个热点（Xiang等，2021）。然而用于临床的细菌素极少，目前只有乳酸链球菌产生的Nisin已被允许作为食品防腐剂，实现工业化（王利君等，2020）。许女等（2016）发现，KF1细菌素对多重耐药金黄色葡萄球菌生物被膜的形成，主要的毒力因子具有明显的抑制作用。陈宏伟等（2020）发现了5株代谢产生细菌素对乳房炎源金黄色葡萄球菌发挥抑制生长作用的菌株。

本研究以金黄色葡萄球菌为指示菌，从奶酪中分离得到一株产细菌素菌株LS-1，通过16S rRNA序列对比分析，鉴定菌株LS-1为L.saniviri。LS-1所产细菌素对奶牛乳房炎主要病原菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、化脓隐秘杆菌）均具有良好抑菌活性。此外LS-1所产细菌素具有良好的酸碱稳定性和热稳定性。菌株LS-1丰富了产细菌素菌株资源，为研究防治金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎的新型药物奠定了基础，有着广阔的应用前景。