不同处理方法对中草药体外抑菌及抗氧化活性的影响

王宝刚，杨立军，曹鹏亮，梁晓凯，汪金萍，陈 琼*

（1.信阳农林学院食品学院，河南信阳 464000；2.信阳农林学院制药工程学院，河南信阳 464000）

为防治疾病，禽畜生产养殖过程中约有60多种抗生素被用于动物临床治疗中，大量抗生素的使用会导致禽畜体内微生物菌群失调并产生耐药性（Zhang，2015）。刘肖利等（2021）从采集的7个奶牛场中患乳房炎奶牛乳汁样本分离出5株金黄色葡萄球菌，结果显示这些金黄色葡萄球菌最少耐1种药，最多耐5种药物，部分耐药率为60%～80%；张璐等（2020）研究表明，鸡白痢沙门菌2001—2010年比1970—2000年药物耐药率及耐药种类升高；Xin等（2021）分析2008—2017年美国食品和药物管理局收集的46937份禽肉样本的数据，表明与减少抗生素使用样本中的分离株相比，常规样本中的沙门氏菌分离株对三种或三种以上抗菌药物的耐药几率（多重耐药）高2.61倍。在养殖过程中减少抗生素的使用势在必行，2018年农业农村部组织制定了《兽用抗菌药使用减量化行动试点工作方案（2018-2021年）》。

中草药具有多成分、多靶点、多途径、多环节特点，在诊治禽畜感染性疾病方面被证实有一定的疗效，可在一定程度上降低多重耐药菌发病的风险。冯平等（2017）表明，连翘、黄连、金银花、鱼腥草、蒲公英可作为药物预防和治疗奶牛乳房炎。蒲公英、金银花、菊花作为药食兼用的传统中药材在我国使用历史悠久，均具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤的功效 （朱文卿，2021；周衡朴，2019；Nikzad，2017）。本文通过探索不同处理方法对蒲公英、金银花、菊花这三种中药材抑菌效果和抗氧化活性的影响，旨在为它们在禽畜养殖方面的应用提供一定的参考。

1 试验材料

1.1 测试菌种 金黄色葡萄球菌、甲型副伤寒沙门氏菌均由信阳农林学院制药工程学院微生物实验室提供，这两种菌均为禽畜类常见致病菌。

1.2 中草药与试剂 蒲公英、金银花、菊花购自信阳美锐大药房；乳酸菌购自信阳恒大华联超市，蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、营养琼脂均购自上海博微生物科技有限公司；DPPH、邻苯三酚均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 主要仪器 SW-CJ-2FD实用型双人单面垂直净化工作台，苏州安泰空气技术有限公司产品；XFH-75CA型电热压力蒸汽灭菌器，浙江新丰医疗器械有限公司产品；DNP型电热恒温培养箱，宁波江南仪器厂产品；DZKW-4型电热恒温水浴锅，北京中兴伟业世纪仪器有限公司产品；RE52CS型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品；Tu-1900紫外可见光分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品。

2 试验方法

2.1 7种组方组合方法 将三种中草药按照不同方式进行组合，共7组，分别为：A组蒲公英12.0 g，B组金银花12.0 g，C组菊花12.0 g，D组蒲公英、金银花各6.0 g，E组蒲公英、菊花各6.0 g，F组金银花、菊花各6.0 g，G组蒲公英、金银花、菊花各4.0 g。

2.2 水煎煮处理方法 将以上7种组方分别加入100 mL的蒸馏水浸泡30 min，再加热煎煮30 min后，用纱布过滤，滤渣再加水提取2次，合并3次滤液得水煎煮原液。将水煎煮原液于50℃、50 r/min旋转蒸发浓缩至浸膏状，用蒸馏水定容得浓缩液（1.0 g/mL）。浓缩液用滤膜（孔径0.45μm）过滤装于无菌具塞试剂瓶内密封，4℃保存备用。

2.3 乳酸菌发酵处理方法 将7种组方分别装入300 mL三角瓶中，加入蒸馏水200 mL，密封。将三角瓶置于65℃水浴锅中，保温30 min，进行巴氏消毒。无菌条件下，称取0.4 g乳酸菌粉加入巴氏消毒后的7组三角瓶中，然后将它们放于恒温培养箱中，37℃发酵7 d，每24 h手动晃动一次。发酵结束，将发酵液进行抽滤得发酵浓缩液，后续操作同2.2。

2.4 体外抑菌试验

2.4.1 培养基制备 肉汤培养基制备：取蛋白胨10.0 g，牛肉膏粉3.0 g，氯化钠5.0 g，加1000 mL蒸馏水，加热溶解，121℃灭菌30 min。营养琼脂制备：取营养琼脂粉33.0 g，加1000 mL蒸馏水，加热溶解，121℃灭菌30 min。

2.4.2 菌悬液制备 在无菌条件下，取甲型副伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌各一菌环接种于肉汤培养基试管，37℃静置培养24 h，取出，使用无菌水调整菌悬液浓度约106～107CFU/mL。

2.4.3 药敏片制作 用打孔器制作若干圆形滤纸片（直径6 mm），将其按需分装入2 mL离心管中，高压灭菌后，加入不同处理方法所得的7种组方中草药浓缩液，室温放置30 min，无菌条件下取出滤纸片于无菌平皿中，50℃条件下烘干，4℃保存，备用。

2.4.4 滤纸片法测体外抑菌效果 用移液枪吸取50μL测试菌悬液滴加到制备好的营养琼脂平板上，用涂布棒涂布均匀。待其表面无水后用无菌镊子将制备好的药敏片贴附于培养基上，37℃培养18 h，取出，用游标卡尺十字交叉法测量抑菌圈直径。判定标准：抑菌圈直径（d）＞20 mm为极敏，15 mm＜d≤20 mm为高敏，10 mm＜d≤15 mm为中敏，d≤10 mm为低敏，“—”表示无抑菌圈（姚火春，2012）。

2.5 抗氧化性试验 利用得到的各种提取物原液进行超氧阴离子自由基清除能力和DPPH自由基清除能力的测定，具体参考姜峰（2021）方法。

2.6 数据的统计分析 试验数据采用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析（S-N-K检验）和多重比较，试验结果表示为“平均值±标准误”，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著，P＞0.05表示差异不显著。

3 结果与分析

3.1 体外抑菌试验3.1.1 7种组方水煎煮液体外抑菌效果 由表1可知，7种组方水煎煮浓缩液，对金黄色葡萄球菌和甲型副伤寒沙门氏菌均表现出不同的抑制效果，不同组方之间均表现差异显著（P＜0.05）；金黄色葡萄球菌对E组表现出高敏，对A、B、D、F、G组表现为中敏，对C组表现为低敏，最大E组（蒲公英+菊花）比最小C组（菊花）抑菌圈直径大68%；甲型副伤寒沙门氏菌对A组表现出极敏，对G组表现出高敏，对D、E、F组表现为中敏，对B、C组表现为低敏，最大A组（蒲公英）比最小C组（菊花）抑菌圈直径大224%。

表1 7种组方水煎煮液抑菌圈直径mm

3.1.2 7种组方乳酸菌发酵液体外抑菌效果 由表2可知，7种组方乳酸菌发酵浓缩液，对金黄色葡萄球菌和甲型副伤寒沙门氏菌均有较好的抑制效果，不同组方之间均表现差异显著（P＜0.05）；金黄色葡萄球菌对B、D、F、G组表现极敏，对A、C、E组表现为高敏，最大F组（金银花+菊花）比最小C组（菊花）抑菌圈直径大61%；甲型副伤寒沙门氏菌对A、C、D、F、G组方表现极敏，对B组方表现为高敏，最敏感的D组（蒲公英+金银花）比最小B组（金银花）抑菌圈直径大62%。

表2 7种组方乳酸菌发酵液抑菌圈直径mm

3.1.3 不同处理方式抑菌效果比较 为了较直观地比较水煎煮和乳酸菌发酵抑菌效果的差异，按测试致病菌不同将7种组方抑菌圈直径如图1、图2所示。从图1和图2看出，针对金黄色葡萄球菌和甲型副伤寒沙门氏菌，每种组方的乳酸菌发酵液均比水煎煮液抑制效果好。依次对比从A组到G组的抑菌圈直径，乳酸菌发酵较水煎煮，对于金黄色葡萄球菌分别提高了63%、75%、65%、85%、20%、135%、112%，对于甲型副伤寒沙门氏菌分别提高了12%、128%、329%、123%、89%、106%、81%。

图1 不同处理方式对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

图2 不同处理方式对甲型副伤寒沙门氏菌的抑菌效果

3.2 抗氧化试验

3.2.1 7种组方水煎煮液抗氧化效果 由表3可知，7种组方水煎煮原液，对超氧阴离子自由基和DPPH自由基均有不同程度的清除能力，不同组方之间均表现差异显著（P<0.05）；对超氧阴离子自由基清除能力依次为G组＞D组＞B组＞F组＞E组＞C组＞A组，G组（蒲公英+金银花+菊花）比A组（蒲公英）清除率高263%；对DPPH自由基清除能力依次为B组＞C组＞G组＞F组＞D组＞E组＞A组，B组（金银花）比A组（蒲公英）清除率高127%。

表3 7种组方水煎煮液抗氧化能力%

3.2.2 7种组方乳酸菌发酵液抗氧化效果 由表4可知，7种组方乳酸菌发酵原液，对超氧阴离子自由基和DPPH自由基均有不同程度的清除能力，组方之间均表现差异显著（P＜0.05）；对超氧阴离子自由基清除能力依次为E组＞C组＞G组＞A组＞D组＞B组＞F组，E组（蒲公英+菊花）比F组（金银花+菊花）清除率高440%；对DPPH自由基清除能力依次B组＞F组＞C组＞D组＞E组＞G组＞A组，B组（金银花）比A（蒲公英）组清除率高137%。

表4 7种组方乳酸菌发酵液抗氧化能力%

3.2.3 不同处理方式抗氧化活性比较 按自由基不同，将7种组方的水煎煮液和乳酸菌发酵液的抗氧化活性进行比较，如图3、图4所示。从图3和图4看出，针对超氧阴离子自由基和DPPH自由基，每种组方的清除效果均是乳酸菌发酵液比水煎煮液高。依次对比从A组到G组抗氧化结果，乳酸菌发酵较水煎煮，对于DPPH自由基分别提高了23%、28%、16%、44%、49%、37%、8%；对于超氧阴离子自由基分别提高了287%、9%、798%、22%、535%、14%、104%。

图3 不同处理方式对超氧阴离子自由基清除能力

图4 不同处理方式对DPPH自由基清除能力

4 讨论与结论

水煎煮是我国中草药临床应用最早、最广泛方法之一。通过煎煮，可减少药物的副作用降低毒性（周友红，2010），促进药物有效成分的浸出（黄斯，2015），利于组方中其他难溶性、挥发性物质析出（张明明，2012）。发酵法也是中草药炮制方法的一种，如常用的六神曲、淡豆豉、百药煎等就是通过发酵炮制的中草药。中草药通过发酵可提高有效成分的提取率（杨新波，2022），降低毒副作用（Lin，2020），并产生新的成分（Chen，2019），中草药发酵尤其是益生菌发酵中草药越来越受重视。

乳酸菌作为益生菌发酵中草药在禽畜养殖中有较好的应用效果。郭宏伟等（2019）统计发现，投喂经乳酸菌发酵的生乳散比没发酵生乳散的妊娠母猪产活仔数高10.09%。李雪雁等（2020）用乳酸菌发酵添加了黄芪、淫羊霍、甘草等的饲料饲喂雏鸡，4～5周后统计得出发酵中草药制剂提高了雏鸡生长性能，降低了料肉比。

本试验利用乳酸菌发酵蒲公英、金银花、菊花三种中草药的7种组方，它们的抑菌效果和抗氧化活性均高于水煎液。可能是由于经乳酸菌发酵后，产生了一些新的物质，如有机酸（胡爱心，2021）、细 菌 素（Baliv，2016）、过 氧 化 氢（Knaus，2017）等，它们均被证明有一定的抑菌及抗氧化活性（张开屏，2021），这与其他中药发酵结果有相似之处。如白俊毅等（2020）表明，连栀矾发酵后抑菌效果增加，并经HPLC测定发现发酵后连栀矾溶液活性成分发生变化，产生了新的成分，其认为这些是发酵后抑菌活性增强的原因；郑慧敏等（2021）对五谷虫粉水提物发酵前后抑菌试验进行了比较，证明发酵后五谷虫粉的抑菌效果提高；张红艳等（2021）表明，发酵中草药方剂相比直接熬制，锌、铜、铁和钙的含量显著提高，DPPH自由基的清除能力提高2.2倍，羟基自由基的清除能力提高4.2倍，总多酚含量提高了2.2倍，对沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌活性更强。

综上所述，本试验条件下，对金黄色葡萄球菌抑菌效果最佳的是乳酸菌发酵金银花+菊花组方，抑菌圈直径为（24.39±1.63）mm；对甲型副伤寒沙门氏菌抑制效果最好的是乳酸菌发酵蒲公英+金银花组方，抑菌圈直径为（31.58±0.95）mm；对超氧阴离子自由基清除能力最强的是乳酸菌发酵蒲公英+菊花组方，清除率为（100±1.93）%；对DPPH自由基清除能力最强的是乳酸菌发酵金银花组方，清除率为（85.47±2.56）%；7种组方之间抑菌效果和抗氧化活性方面均存在显著差异性；乳酸菌发酵液抑菌效果和抗氧化活性均优于水煎煮液，抑菌圈直径比水煎液提高12%～329%，抗氧化能力比水煎液提高8%～798%。