通络明目膏对糖尿病大鼠视网膜血管内皮生长因子表达的影响

凌梓韵 陈丽华▲ 李霭燕 吴小桃

1.广州市番禺区中医院眼科，广东广州 511400；2.广州市番禺区中医院药学部，广东广州 511400

糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）为患病率较高的糖尿病慢性微血管并发症，其发生率为24%～70%[1]，若不及时治疗可能造成不可逆性视功能受损。DR的发病机制较为复杂，现代医学认为其发生、发展与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量异常密切相关，其可促使血管内皮细胞不断被增殖分化，进而诱使血管新生[2]。因此，探讨安全有效的方法抑制视网膜新生血管形成是DR治疗的内容之一。中医学认为，DR早期多是由于气阴两虚所致，而随着病程延长会逐步发展为阴阳两虚、气滞血瘀[3]。通络明目膏为广州市番禺区中医院（我院）的院内方，具有益气养阴、活血化瘀、通络明目的功效，符合DR的中医辨证论治原则。现为进一步明确通络明目膏治疗DR的可能机制，本研究从VEGF角度，观察通络明目膏对DR大鼠的治疗作用。

1 资料与方法

1.1 实验动物

选择60只无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级多雷（sprague dawley，SD）大鼠[许可证号：SYXK（粤）2020-0102]，均为雄性，体重200～250 g，平均（225.93±15.52）g，均由广州中医药大学实验动物中心统一饲养，饲养环境温度18℃～20℃，湿度50%～60%，应用实验用鼠维持饲料（江苏省协同医药生物工程有限责任公司）、三级清洁用水喂养，自由摄食饮水。所有实验大鼠均经眼部检查证实无异常，无全身器质性病变。本研究获得广州市番禺区中医院医学伦理委员会审批，可开展研究。

1.2 药物和试剂

通络明目膏经我院中药房制作，其组方为：葛根、生地、熟地、鸡血藤、茯苓、淮山各20 g，党参、黄芪、决明子、青箱子、菊花、茺蔚子、谷精草、麦冬各15 g，玄参、丹参、柴胡、瓜蒌皮、牡丹皮、泽泻各12 g，山茱萸、田七各10 g，法半夏、陈皮各6 g，山楂、五味子、当归各5 g，龟甲胶、黄明胶各2 g。羟苯磺酸钙胶囊（北京京丰制药，批准文号：H20010795）；Streptozocin 链脲佐菌素（美国Sigma公司）。

大鼠胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor 1，IGF-1R）ELISA试剂盒（通蔚生物，批号：193001-14-8）；大鼠ET-1 ELISA试剂盒（科顺生物，货号：KS10931）；大鼠VEGF ELISA试剂盒（上海今品化学技术有限公司，货号：KS15297）；大鼠VEGFR-2/KDR ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号：KS15373）；兔抗大鼠VEGFA/VEGF多克隆抗体（美国LifeSpan Biosciences，货号LS-C210581）；VEGFR2多克隆抗体（上海泽叶生物科技有限公司，货号：KS12000）。

1.3 方法

1.3.1 实验分组 以随机数表法将纳入研究的60只实验大鼠分成空白组（n=10）、模型组（n=10）、阳性对照组（n=10）、通络明目膏低剂量组（n=10）、通络明目膏中剂量组（n=10）、通络明目膏高剂量组（n=10）。

1.3.2 建模 除了空白组，其余小组均通过应用2%链脲佐菌素，并给予高脂高糖饮食以建立DR大鼠模型。具体方法：各组在实验前先适应性喂养7 d，建模前禁食12 h，除空白组外的其余5组大鼠经腹腔注射60 mg/kg链脲佐菌素。3 d后检测各组大鼠的空腹血糖，如果结果显示＞16.7 mmol/L，提示大鼠糖尿病模型建立成功。各组每天均给予眼底检测，发现视网膜有血管扩张或有血管瘤形成等眼底血管异常，且持续1周，提示DR建模成功。

1.3.3 药物干预方法 确定DR大鼠建模成功后，通络明目膏低剂量组、通络明目膏中剂量组、通络明目膏高剂量组分别灌胃10、40、60 mg/（kg·d）通络明目膏，阳性对照组灌胃等效剂量100 mg/（kg·d）的羟苯磺酸钙胶囊，模型组、空白组灌胃等量蒸馏水，干预12周。

1.4 观察指标

①干预12周后，比较各组大鼠外周血血清胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）、内皮素-1（endothelin-1，ET-1）、VEGF表达量。先对大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠将其麻醉，取大鼠腹主动脉血，进行离心处理（离心速率3000 r/min，15 min）取血清样本，采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），严格按照试剂盒说明书进行检测。②干预12周后，比较各组大鼠视网膜组织中血管内皮生长因子受体-2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）、VEGF表达情况。以断头法将大鼠处死，取大鼠右眼或左眼置于4%多聚甲醛溶液固定，进行脱水→石蜡→包埋→切片，应用免疫组化法检测，即先对石蜡切片进行脱蜡→梯度乙醇脱水→用3%过氧化氢酶氧化将切片上的内源性过氧化物酶清除→滴加一抗，孵育24 h→滴加二抗，孵育2 h→显色，复染→梯度乙醇脱水和封片。最后在光学显微镜下观察切片，并应用Image-proplus 6.0图像分析处理软件计算VEGFR-2、VEGF阳性表达水平。③病理学观察：取“②”中各组的石蜡切片进行HE染色，在光镜下观察各组视网膜病理改变。

1.5 统计学方法

应用SPSS 16.0统计学软件分析数据，计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较行t检验，多组间比较行单因素方差分析。计数资料用[n（%）]表示，行χ2检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清IGF-1、ET-1、VEGF和视网膜组织VEGFR-2、VEGF阳性表达情况比较

干预12周后，模型组大鼠视网膜组织VEGFR-2、VEGF阳性表达以及血清IGF-1、ET-1、VEGF表达量显著高于其他5组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。通络明目膏低剂量组的血清IGF-1、ET-1、VEGF表达量及视网膜组织VEGF、VEGFR-2阳性表达较阳性对照组明显升高，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；通络明目膏中剂量组的血清IGF-1、ET-1、VEGF表达量及视网膜组织VEGF、VEGFR-2阳性表达与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05）；通络明目膏高剂量组的血清IGF-1、ET-1、VEGF表达量及视网膜组织VEGF、VEGFR-2阳性表达低于阳性对照组，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表1。

表1 各组血清IGF-1、ET-1、VEGF和视网膜组织VEGF、VEGFR-2阳性表达情况比较

2.2 病理学观察结果

镜检下显示，空白组大鼠视网膜内结构清晰分明，见细胞齐整，无显著异常，见图1；模型组大鼠的视网膜内各层组织结构纹理稀松，颗粒排列无规律，微血管舒张，血管壁扭曲，组织中重度水肿，内皮细胞增生，见图2；阳性对照组大鼠视网膜内结构清晰，视杆视锥细胞排列齐整。管壁变厚，且见内皮细胞增生，大鼠视网膜组织略有水肿，见图3；通络明目膏低剂量组大鼠视网膜细胞排列基本有一定的规律，组织水肿程度相对减轻，见视网膜色素上皮细胞有破裂，视网膜下出血，见图4；通络明目膏中剂量组大鼠视网膜细胞排列较齐整，各个层次的结果清楚可见，微血管舒张减轻，管壁增厚，组织水肿减轻，见图5；通络明目膏高剂量组大鼠视网膜各层次次齐整清楚，组织水肿不明显，微血管舒张不明显，管壁增厚，见图6。

图1 空白组（HE染色，×200）

图2 模型组（HE染色，×200）

图3 阳性对照组（HE染色，×200）

图4 通络明目膏低剂量组（HE染色，×200）

图5 通络明目膏中剂量组（HE染色，×200）

图6 通络明目膏高剂量组（HE染色，×200）

3 讨论

DR属于糖尿病性微血管改变，大量研究报道其病理特征主要是视网膜血管异常生长[4-5]。VEGF作为促血管生成因子，可与VEGFR-2相结合，以增加促血管生成活性。无论是临床研究还是动物实验均有报道，DR个体尤其是视网膜组织呈VEGF高表达[6-7]。VEGF可经自分泌或者是旁分泌途径特异性与血管内皮生长因子受体连接，介导内皮细胞活化，进而促使微血管渗透性升高，引起血管新生[8]。在健康状况下，哺乳类动物的视网膜组织VEGF呈低表达，以保证视网膜局部血管完整性，但当VEGF过度表达时，可促使新生血管形成[9]。除此之外，机体中还有很多细胞因子、生长因子参与到新生血管形成过程中，如IGF-1[10]、ET-1等[11]。本研究结果显示，模型组大鼠视网膜组织VEGFR-2、VEGF阳性表达以及血清IGF-1、ET-1、VEGF较空白组升高，与马莉等[12]研究结果相吻合，提示DR的视网膜内VEGF、VEGFR-2及其他促血管生成因子呈高表达。

在中医学中，DR可归于“暴盲”“消渴目病”的范畴。在中医的长久理论和实践研究下，对于DR的病因病机层面，相关专业人士基本已形成共识，为“先天不足，后天失养，致阴亏内热，伤津耗气，肝肾亏虚；因虚致瘀，脉络瘀阻，目窍失养”，气阴两虚、血瘀分别为病症本、标，两者相互作用[13]。我院自制的通络明目膏主治络脉瘀阻、气阴两虚型DR，药膏中含有的山茱萸、熟地、麦冬、龟甲胶、黄明胶等均为滋阴类中药，能够滋阴补肝肾；牡丹皮、生地、玄参等不仅能够滋阴，还可降虚火；田七、鸡血藤、当归、丹参、山楂等均为活血化瘀类中药，可活血通络散瘀；菊花、决明子、谷精草、青箱子均有清热明目功效，再配伍柴胡、葛根，利用其升阳的作用使诸药循经上行，药效直达病处；诸药合用起到活血化瘀、通络明目、益气养阴的作用。现代药理学也报道[14]，三七、丹参、山楂均能够改善血管内皮功能，使血液黏稠度降低，并可抑制各种原因所致的血管通透性升高。熟地黄、山萸肉、黄芪、党参等也有一定的抗氧化能力；菊花可以降低局部组织微血管密度，改善微循环[15]。本研究对DR大鼠分别予以羟苯磺酸钙胶囊和通络明目膏干预治疗，结果发现，以通络明目膏中剂量干预的大鼠血清IGF-1、ET-1、VEGF水平及视网膜组织VEGFR-2、VEGF阳性表达与羟苯磺酸钙胶囊干预大鼠比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05），而通络明目膏高剂量干预的大鼠血清IGF-1、ET-1、VEGF水平及视网膜组织VEGF、VEGFR-2阳性表达较羟苯磺酸钙胶囊干预大鼠降低（P＜ 0.05），提示应用高剂量通络明目膏治疗DR能够通过降低促血管生成因子过度表达，抑制视网膜血管生成，改善视网膜病变，且疗效与剂量呈正相关。

综上，糖尿病大鼠的外周血和视网膜组织内存在VEGF过量表达，而经高剂量通络明目膏干预后能够显著改善视网膜微血管变化，发挥视网膜保护作用，但其具体作用机制需进一步验证。