Pin1 通过调控脂质代谢关键酶影响宫颈癌细胞的增殖及凋亡

海 燕，美力班·吐尔逊，阿仙姑·哈斯木

（新疆医科大学基础医学院/新疆地方病分子生物学实验室，新疆 乌鲁木齐 836001）

宫颈癌作为第四大全球女性常见癌症，约占所有每年因癌症死亡女性人数的8%[1]。宫颈癌晚期患者主要的死亡原因是由于肿瘤细胞生长速度过快及难以控制的远处淋巴结转移[2]。而过度的细胞增殖及凋亡水平不平衡化在肿瘤萌发过程中发挥着中流砥柱的作用[3]。据报道，在肿瘤的恶性增殖过程中，血管生成不足，肿瘤微环境具有缺氧、酸性、营养贫乏的特点，因此，肿瘤细胞必须调整能量代谢以应对这种不利的微环境，并维持肿瘤细胞的快速生长和增殖[4]。其中，肿瘤细胞中脂质代谢的改变在恶性程度较高的肿瘤中尤为活跃[5]。既往研究表明，非癌性宫颈组织、浸润前发育不良的宫颈上皮和浸润性宫颈癌中的脂滴逐渐增加[6]。

Pin1 是肽基脯氨酰异构酶（peptidyl-prolyl cis/trans isomerase，PPIase）家族的成员，在许多癌症中过表达，其通过破坏原癌基因和肿瘤抑制因子之间的平衡来促进肿瘤发生，并激活许多癌症驱动途径促进肿瘤的恶性增殖[7]。据报道，Pin1 是脂质亲电体修饰的靶标[8]，被视为治疗血脂异常及相关疾病的靶点[9]。乙酰辅酶A 羧化酶1（acetyl-CoA carboxylase 1，ACC1）可通过催化乙酰辅酶A 转化为丙二酰辅酶A，被脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FASN）所利用进而调节脂肪酸从头合成，从而满足肿瘤细胞的能量供应，在肿瘤的脂质代谢调节过程中至关重要[10]。课题组前期研究发现，Pin1 能够促进宫颈癌细胞内的中性脂肪含量[11]。然而Pin1 在宫颈癌脂质代谢中的作用机制并未明确，Pin1 是否通过参与调节脂质代谢关键酶影响宫颈癌细胞的增殖和凋亡尚待研究。本实验以宫颈癌SiHa 细胞为研究对象，建立了shPin1 稳转细胞系，检测Pinl 和 ACC1，FASN 蛋白表达水平，并分析Pin1 对宫颈癌细胞恶性增殖及凋亡能力的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂

人宫颈癌细胞系购买于普诺赛公司；慢病毒由吉凯公司构建；DMEM 培养基、青霉素-链霉素及胰酶（Hyclon）；胎牛血清（Gibico）；ACC1、FASN、Caspase-8、BCL-2、GAPDH 抗体（Abcam）；C-myc 抗体（ZENBIO）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与处理慢病毒转染前将一定数量细胞接种于六孔板中，按照吉凯公司提供的说明书进行转染。实验分组为对照组（sh-NON）、敲低组1（shPin1-1）和敲低组2（shPin1-2）。

1.2.2 实时荧光定量PCR 实验转染后的细胞生长至一定密度时，提取细胞内总RNA，参照试剂盒提供的说明书对得到的RNA 进行逆转录，通过实时荧光定量PCR 法检测分析各基因表达水平，β-actin 为内参，实验重复3 次。引物序列，见表1。

表1 qRT-PCR 检测基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR detection genes

1.2.3 Western blot 实验待细胞状态良好且生长至一定密度时，提取细胞总蛋白，将得到的样品进行免疫印迹检测，ECL 显色法于凝胶成像系统上显影拍照，实验重复3 次。

1.2.4 平板克隆实验6 孔板中接种1 000 个细胞，隔天换液，培养12d，观察细胞生长情况，固定、染色并采图，实验重复3 次。

1.2.5 CCK-8 实验将SiHa 细胞接种于96 孔板中，每组设5 个复孔，培养24 h 后加入CCK-8工作液，酶标仪OD450，实验重复3 次。

1.2.6 流式细胞术收集细胞沉淀，PBS 洗3 次，每孔加入500 µL 1×Binding Buffer 工作液和5 µL AnnexinV-PE、5 µL AnnexinV-7AAD，混匀后上机检测，实验重复3 次。

1.2.7 GEPIA.2（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index）用于分析ACC1、FASN 在宫颈癌及非肿瘤组织中的表达情况。

1.3 统计学处理

GraphPad Prism 8.0 软件用于统计分析。采用独立样本t检验对两组数据进行比较，以均数±标准差描述，采用单因素方差分析方法分析各组间数据，当P＜ 0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Pin1 在宫颈癌中的表达

Western Blot 检测Pin1 蛋白在Hela、SiHa、H8 细胞的表达，结果显示Pin1 蛋白在宫颈癌细胞中高表达，且在SiHa 细胞中表达水平最高（P＜0.05），见图1，故选取SiHa 细胞进行Pin1 低表达慢病毒的转染。

图1 Pin1 蛋白在宫颈癌及正常宫颈上皮的表达情况Fig.1 The Expression of Pin1 protein in cervical cancer and normal cervical epithelium

2.2 慢病毒转染效率的测定

Western Blot 实验和实时荧光定量 PCR 实验检测shPin1-NON 组、shPin1-1 组和shPin1-2 组细胞中Pin1 蛋白和mRNA 的表达情况。结果显示shPin1-1 组和shPin1-2 组Pin1 蛋白和mRNA表达均显著低于shPin1-NON 组。结果提示Pin1表达水平被有效下调（P＜ 0.05），见图2。

图2 检测Pin1 慢病毒转染效率Fig.2 Detection of Pin1 lentiviral transfection efficiency

2.3 Pin1 对宫颈癌脂质代谢关键酶的影响

通过GEPIA2 分析了来自TCGA 数据库的宫颈癌和正常宫颈组织RNA 测序数据中ACC1、FASN mRNA 的表达。结果显示，宫颈癌中ACC1、FASN mRNA 表达水平高于非肿瘤宫颈组织（P＜0.05），见图3A。且课题组前期研究发现，宫颈癌组织中 Pinl 与ACC1 蛋白的表达呈正相关[10]。qRT-PCR 和Western Blot 检测shPin1-NON 组、shPin1-1 组和 shPin1-2 组中 ACC1、FASN mRNA 和蛋白表达情况，结果显示shPin1-1 组和shPin1-2 组ACC1、FASN mRNA 和蛋白表达均显著低于shPin1-NON 组（P＜ 0.05），见图3B、图3C、图3D。以上结果提示，协调Pin1 的表达可有效降低宫颈癌细胞中脂质合成原料的含量，从而抑制脂肪酸合成关键酶的表达进而抑制细胞内脂质的蓄积。

图3 shPin1 对宫颈癌SiHa 细胞脂质代谢关键酶的影响Fig.3 The effect of shPin1 on key enzymes in lipid metabolism in SiHa cells of cervical cancer

2.4 Pin1 对SiHa 细胞增殖、凋亡及其相关蛋白的影响

Western Blot 结果显示，BCL-2、C-myc 蛋白表达随着Pin1 的下调被抑制而Caspase-8 蛋白表达则被上调，见图4A、图4B；CCK-8 及平板克隆实验结果显示，集落形成能力，见图4C 及细胞增殖能力，见图4D，均随着Pin1 的下调而降低，而流式细胞术结果显示，细胞总凋亡率呈现上升趋势，见图4E。以上结果提示，下调Pin1可有效抑制细胞增殖能力并上调细胞凋亡率（P＜0.05）。

图4 下调Pin1 后宫颈癌SiHa 细胞增殖和凋亡情况Fig.4 Proliferation and apoptosis of SiHa cells in cervical cancer after downregulation of Pin1

3 讨论

目前，测试并应用了各种分子生物学、遗传学和免疫组织化学研究宫颈癌发生机制的方法，靶向抗肿瘤药物以及诊断、预后和预测生物标志物尚处探索阶段。宫颈癌发病机制的许多问题尚未得到充分研究，许多表征宫颈癌发生各个阶段的生物标志物的作用仍不清楚[12]。

Pin 基因位于染色体19p13.2 上，由N 端蛋白质结合WW 域和C 端 PPIase 域组成编码Pin1 异构酶，可使pSer/Thr-Pro 基序中的脯氨酰键异构化。Pin1 最初被证实为参与细胞周期进程，但越来越多的证据表明Pin 介导的脯氨酰异构化在多种生物过程中起着至关重要的作用[13]。本研究检测了2 种宫颈癌细胞系（Hela、Siha）和正常宫颈上皮细胞系中Pin1 蛋白的表达情况，结果发现Pin1 在Hela、Siha 细胞中均呈高表达，提示Pin1 可能与宫颈癌的进展相关。

肿瘤细胞的恶性增殖及凋亡抑制是肿瘤不良预后的始动因素。据报道，Pin1 可通过破坏促凋亡和抗凋亡信号转导及增殖促进因子和增殖抑制因子的平衡，促进肿瘤的发生、发展和对细胞死亡的抵抗，并实现复制永生化[14]。在胃癌细胞中，Pin1 可以通过靶向BRD4 以调节细胞增殖[15]。本研究发现，下调Pin1 后，宫颈癌Siha 细胞的增殖能力明显被抑制，凋亡水平显著上升；Pin1 的表达水平与增殖相关蛋白c-myc 及抗凋亡相关蛋白Bcl-2 正相关，而与促凋亡相关蛋白Caspase-8 负相关，揭示了Pin1 对宫颈癌细胞增殖及凋亡的重要影响。脂质代谢失调是癌症中最突出的代谢改变之一。癌细胞利用脂质代谢来获取能量、生物膜成分和增殖、存活、侵袭、转移以及对肿瘤微环境影响和癌症治疗的反应所需的信号分子[16]。据报道，脂质代谢的紊乱会干扰肿瘤细胞的致癌途径，并通过分泌相关代谢因子干扰正常细胞群[17]。本研究发现，宫颈癌细胞中，沉默Pin1 可下调脂质代谢关键酶ACC1、FASN 的表达，提示Pin1 可能通过影响脂质代谢途径影响宫颈癌细胞的增殖及凋亡。后续我们将进一步研究Pin1对脂质代谢途径中脂质合成原料的生成及脂肪酸摄取能力的影响等方面分析Pin1 对宫颈癌细胞增殖、凋亡的作用机制，为宫颈癌的靶向攻克治疗提供一定的理论基础。