细胞焦亡参与早期子鼠坏死性小肠结肠炎的发病

王 静 ，米弘瑛 ，张 熠 ，李 丽 ，余建华 ，刘丽巧 ，刘庆瑜 ，王立伟

（1）大理大学临床医学院，云南 大理 671003;2）云南省第一人民医院儿科，云南 昆明 650032;3）昆明理工大学食品科学与工程学院，云南 昆明 650032;4）云南省第一人民医院临床医学研究中心，云南 昆明 650032;5）昆明理工大学临床医学院，云南 昆明 650032）

新生儿坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是新生儿常见的消化道疾病，临床上以腹胀、呕吐、便血为主要表现，严重者可发生消化道穿孔、弥漫性腹膜炎、休克、多器官功能衰竭[1-3]。NEC 发病的基本机制是肠道炎症反应，近年来关于NEC 发病机制的研究成为热点，但至今尚未阐述清楚。有研究者发现，细胞焦亡（Pyroptosis）的关键分子在NEC 中会明显升高，如白细胞介素（interleukin，IL）-1β、白细胞介素（interleukin，IL）-18、天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）-1、消皮素 D（gasdermin D，GSDMD）等，从而证实了细胞焦亡参与NEC 的发病[4-6]。但是这些关键分子蛋白是否会在早期NEC 中明显升高，值得进一步实验论证。

1 材料与方法

1.1 NEC 动物模型建立及分组

以新出生的子鼠为研究对象，买怀孕14 d 的SD 孕鼠，购自昆明理工大学动物实验中心，孕鼠在动物房适应7 d 左右后待其自然生产。将新出生的子鼠按照完全随机分组方法，分为实验组和对照组。对照组子鼠15 只，与母鼠同笼，由母鼠以鼠乳喂养，待其自然生长，不做任何处理。最终选取12 只正常子鼠纳入实验对象。

实验组子鼠20 只，运用缺氧、喂养不当、寒冷刺激等处理诱导子鼠发病，将子鼠放置在缺氧培育箱中，缺氧箱内气体是5%氧气混合95%氮气，每天缺氧处理3 次，每次10 min，连续处理3 d，间隔期将子鼠放置4 ℃的冰箱进行寒冷刺激，同样是每天进行3 次，每次10 min，连续处理3 d，诱导过程中以鼠乳代用品人工喂养[7-8]。排除死亡子鼠，将实验组出现活动能力减少、反应变差、摄食减少、腹胀、胃潴留的子鼠定义为早期NEC 模型子鼠，共计12 只，并纳入实验对象。

1.2 诊断标准

本次研究早期NEC 小鼠模型的定义参考新生儿早期NEC 的诊断标准[9-10]，前期通过对临床上早期NEC 患儿粪便隐血阳性率统计，研究结果提示早期NEC 出现粪便隐血的阳性率不高[11]，故建模中无论子鼠粪便有无肉眼血丝均视为建模成功，上述子鼠的症状与临床中新生儿早期NEC 症状基本一致。

1.3 蛋白浓度的测定

将所有建模成功的子鼠处以安乐死，立即抽取处以安乐死子鼠的血液于收集管中，小心分离出血清，置于-80 ℃冰箱中保存。Elisa 试剂盒由睿信生物公司提供，分别是IL-18、Gasdermin D、Caspase-1 等3 个试剂盒，按照试剂盒的说明书步骤测定血清中目标蛋白分子的吸光度，通过样本的吸光度（OD 值），利用方程计算血清中蛋白分子的浓度。

1.4 统计学处理

本次研究采用随机对照的研究方法，用SPSS 22.0 进行统计学分析，由于蛋白分子浓度总体分布不明，需进行正态性检验，经S-W 检验以及直方图结果显示，各组数据不服从正态分布，因此数据不满足正态分布，故运用秩和检验对上述蛋白分子进行统计分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 实验组与对照组子鼠肠道形态变化

2 组子鼠肠道组织肉眼观察所示：实验组子鼠的肠道在开腹时呈现出肠管 明显积气增粗，取出后如图1A 所示部分肠壁颜色变暗，出现缺血样改变，肠腔内有较多血性液体积聚，肠曲形态自然，肠壁光滑，并未出现明显坏死及串珠样改变；对照组子鼠的肠道在开腹时并无积气表现，取出后如图1B 所示肠管呈淡黄色，肠腔内无血性液体积聚，肠曲形态自然，肠壁光滑。

图1 2 组子鼠肠道组织肉眼观察Fig.1 Macroscopic observation on intestinal tissue of two groups of rats

2.2 血清中Gasdermin D 的浓度分析

用Gasdermin D Elisa 试剂盒检测2 组子鼠血清中Gasdermin D 蛋白分子的浓度，实验组Gasdermin D 浓度的中位数为1.200 0（1.060 0，1.522 5），对照组中位数为1.010 0（0.762 5，1.092 5），运用秩和检验统计分析方法，结果提示P为0.017，差异有统计学意义，可认为实验组子鼠血清中Gasdermin D 的浓度高于对照组，见表1，图2。

表1 2 组子鼠血清中Gasdermin D 浓度差异比较[M（P25，P75）]Tab.1 Comparison of serum Gasdermin D concentration difference between two groups of rats [M（P25，P75）]

图2 2 组血清中Gasdermin D 的浓度分布（ng/mL）Fig.2 Concentration distribution of Gasdermin D in serum of two groups（ng/mL）

2.3 血清中Caspase-1 的浓度分析

2 组子鼠血清中Caspase-1 蛋白分子的浓度，实验组Caspase-1 浓度的中位数为4.090 0（3.117 5，4.917 5），对照组中位数为2.255 0（1.992 5，2.900 0），运用秩和检验统计分析方法，结果提示P＜ 0.001，差异有统计学意义，可认为实验组子鼠血清中Caspase-1 的浓度高于对照组，见表2，图3。

图3 2 组血清中Caspase-1 的浓度分布（ng/mL）Fig.3 Concentration distribution of Caspase-1 in serum of two groups（ng/mL）

表2 2 组子鼠血清中Caspase-1 浓度差异比较[M（P25，P75）]Tab.2 Comparison of Caspase-1 concentration difference between two groups of rats [M（P25，P75）]

2.4 血清中IL-18 的浓度分析

与上述Gasdermin D 及Caspase-1 统计结果不同，用试剂盒检测两组子鼠血清中IL-18 蛋白分子的浓度，实验组IL-18 浓度的中位数为 9.305 0（8.335 0，10.200 0），对照组中位数为8.910 0（8.147 5，10.042 5），秩和检验统计分析结果提示P为0.755，差异无统计学意义，即实验组子鼠血清中IL-18 的浓度与对照组无明显差异，见表3，图4。

图4 2 组血清中IL-18 的浓度分布（ng/mL）Fig.4 Concentration distribution of IL-18 in serum of two groups（ng/mL）

表3 2 组子鼠血清中IL-18 浓度差异比较[M（P25，P75）]Tab.3 Comparison of IL-18 concentration difference between two groups of rats [M（P25，P75）]

3 讨论

NEC 是新生儿最严重的消化道疾病，实质是肠道炎症反应，与肠道菌群失调、喂养不耐受、肠道粘膜屏障受损、免疫力低下、感染、缺血缺氧等因素密切相关[12-15]，主要累及远端小肠和近端结肠[16]，中性粒细胞广泛浸润导致穿孔、腹膜炎、全身性脓毒症和多器官衰竭等危及患儿生命，发病机制过于复杂，目前认为是免疫系统的过度炎症反应，引起剧烈的炎症风暴，导致肠道通透性增加、细菌移位和炎症，但是具体机制尚不明确[17-18]。

近年来，NEC 的炎症机制已然成为国内外学者的研究热点，有研究者发现细胞焦亡这一特殊的细胞死亡方式，参与NEC 的发病。细胞焦亡是一种细胞程序性死亡的方式，而Gasdermin D 是炎症细胞死亡的核心蛋白分子，Gasdermin D 发挥有赖于被活化的Caspase-1、Caspase-11 及人类同源的Caspase-4/5 等切割成有活性的N-端结构域和无活性的C-端结构域，有活性的N-端结构与细胞膜上特定的磷脂分子结合，介导非离子选择性孔道的形成，将细胞内IL-18 等炎症介质释放至细胞外[19-23]。因此，当机体发生细胞焦亡时，血清中IL-18、Gasdermin D、Caspase-1 等蛋白分子的浓度会出现升高。

既往研究者通过建立动物模型探讨NEC 的发病机制[24]，致力于发现对NEC 诊断具有较高敏感度及特异性的生物蛋白分子[25-26]，在研究过程中证实细胞焦亡参与NEC 的发病，但是具体的信号通路仍在进一步研究，同时提出Gasdermin D、Caspase-1 的发现有望为NEC 的抗炎治疗提供新的方向[27-28]。本次研究着力于早期NEC 的发病机制，通过建立与早期临床症状相符的动物模型，探讨IL-18、Gasdermin D、Caspase-1 等细胞焦亡的关键分子蛋白是否会在早期NEC 中明显升高，并且希望通过本次研究，发现适用于NEC 早期诊断的特异性分子蛋白，从而达到提高早期诊断率、及时进行干预的目的[29-30]。

由于早期NEC 患儿肠道炎症较轻，诊断依据主要为临床表现及体征，而实验室检查及影像学检查均无明显特异性，在治疗上通常采取内科治疗方式，因此本次研究基于与临床相符原则，参照早期NEC 的临床症状建立早期NEC 动物模型，以症状为主要建模成功标准，并未对肠道组织进行组织病理学形态分析。在建模过程中，新生子鼠的活动能力、喂养情况、一般反应均变差，并出现腹胀症状，在下一次喂养之前进行胃液回抽可见胃液残留增多，将处以安乐死的子鼠剖开腹部可见肠管明显充气扩张，临床上早期NEC 患儿的影像学征象主要以肠管积气扩张为主，因此本次研究中的动物模型与早期新生儿NEC 临床表现基本一致，并且从图1 中A 图所示，肉眼观实验组子鼠肠腔内可见血性液体增多，部分肠壁呈现缺血样改变，也证实了实验组子鼠肠道已经出现炎症性损伤。

本次研究发现，Gasdermin D、Caspase-1 作为细胞焦亡的关键蛋白分子，在实验组动物模型血清中的浓度出现升高，推断这两种蛋白分子在早期NEC 中就会出现升高，因此细胞焦亡在早期就参与NEC 的发病。Gasdermin D、Caspase-1 可能通过介导炎症分子的逐级激活，参与炎症的发生，导致肠道上皮细胞炎症性损伤，并且可能成为NEC 靶向治疗的特异性蛋白分子[31-32]，通过抑制这两种蛋白分子活性，从而达到抑制炎症逐级激活，减轻NEC 肠道炎症反应。通常IL-18 作为Gasdermin D 的下游炎症分子，理论上实验组血清中的浓度应该高于对照组，而本次研究中IL-18 在两组血清中的浓度无明显差异，由于各炎症分子之间相互激活途径比较复杂，因此有待进一步深入研究证实。

综上所述，本研究通过建立早期NEC 的动物模型，检测血清中Gasdermin D、Caspase-1 等在早期NEC 中明显升高，从而证实了细胞焦亡参与早期NEC 的发病，但是具体的参与机制有待以后各位学者继续研究探索，并且Gasdermin D 及Caspase-1 在新生儿血清中正常的参考值范围值得进一步明确，为临床上早期NEC 的诊断及治疗提供新的方向。