Car-R/Ceph-S 的铜绿假单胞菌OprD 基因突变分析

郑 喜 ，马金珠 ，李琴春 ，高 瑜 ，潘 颖 ，宋贵波

（1）云南中医药大学第二附属医院检验科，云南 昆明 650041;2）昆明医科大学第一附属医院医学检验科/云南省检验医学重点实验室/云南省医学检验临床医学研究中心，云南 昆明 650032）

铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）是一种适应性很强的非发酵革兰阴性细菌，能够引起肺部感染、泌尿系统感染、烧伤创面感染等[1]。其耐药机制复杂，对多种抗菌药物具有固有耐药性，从而使得可选择用于治疗相关感染的抗生素减少[2]。碳青霉烯类抗菌药物在治疗由铜绿假单胞菌引起的感染中起着重要作用[3]。但如今在中国的医院中铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗菌药物有着较高的耐药率，2019 年CHINET 三级医院细菌耐药监测显示铜绿假单胞菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别是27.5%和23.5%[4]。导致铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的机制复杂，以往的研究报道[5]OprD基因的突变、插入和/或缺失是导致碳青霉烯类抗菌药物耐药的常见机制。本研究对铜绿假单胞菌中一种少见的耐药表型：对碳青霉烯类耐药而对头孢菌素敏感（Car-R/Ceph-S）的铜绿假单胞菌的OprD基因序列进行分析，进而对OprD基因突变情况进行研究和探讨。

1 材料与方法

1.1 样本来源

样本收集来自2021 年1 月至2021 年3 月昆明医科大学第一附属医院不同住院患者的痰、引流液、分泌物等标本分离的非重复菌株10 株。经质谱仪（德国布鲁克公司）鉴定均为铜绿假单胞菌。经Vitek 2 Compact 药敏鉴定系统及配套的GN09药敏板卡检测为美罗培南、亚胺培南耐药，头孢他啶和头孢吡肟敏感的分离株10 株，分别标记为P1 至P10。将菌株分离培养后用灭菌的牛奶冻存管冻存。

1.2 主要仪器及试剂

Vitek 2 Compact 药敏鉴定系统以及配套试剂GN09 药敏板卡购自法国生物梅里埃公司、MH 琼脂平板购自郑州安图生物有限公司、哥伦比亚血琼脂平板购自郑州安图生物有限公司、药敏纸片购自英国OXOID 公司、电泳仪购自北京六一生物科技有限公司、DNA 提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司、质谱仪购自德国布鲁克公司、PCR 仪购自西安天隆科技公司、PCR 试剂购自北京宝日医生物技术有限公司、凝胶成像仪购自通用电气（中国）医疗集团公司。

1.3 药敏试验

采用Vitek 2 Compact 自动仪器法和纸片扩散法进行试验。抗生素包括头孢他啶、亚胺培南、头孢吡肟、美罗培南、氨曲南、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星。根据美国临床和实验室标准化委员会（CLSI）2020 年的折点对结果进行判读[6]。以铜绿假单胞菌ATCC 27853 为质控菌株。

1.4 OprD 基因扩增

将冻存的菌株复融后用哥伦比亚血平板转种备用。严格按照试剂盒厂家说明书提取细菌DNA。根据相关文献[7]设计引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成：OprD-R：5'-GTCG ATTACAGGATCGACAG-3'；OprD-F：5'-CGCCG ACAAGAAGAACTAGC-3'，片段大小为1 412 bp。

聚合酶链反应扩增 PCR 反应体系：50 µL。其中，Emerald Amp MAX PCR Master Mix（2×Premix）25 µL，引物OprD-F、OprD-R 各2 µL，无菌水16 µL，DNA 模板5 µL。PCR 反应条件：（1）预变性：95×5 min；（2）循环：95 ℃×30 min，61 ℃×30 min，72 ℃×90 min，共30 个循环；（3）延伸：72 ℃×10 min；（4）4 ℃保存。产物电泳：用2%琼脂糖凝胶电泳，电压120 V，电泳时间20 min。最后在凝胶成像系统上观察结果并保存图片。

1.5 PCR 产物测序

将获得的PCR 扩增产物送北京擎科生物技术有限公司进行Sanger 测序分析，并用DNAstar 序列分析软件将核苷酸序列翻译成氨基酸链，再与铜绿假单胞菌PAO1 菌株的OprD 蛋白序列作比对分析。

2 结果

2.1 Car-R/Ceph-S 铜绿假单胞菌的耐药特点

10 株受试菌株对亚胺培南和美罗培南均表现为耐药，对头孢他啶、头孢吡肟和阿米卡星均表现为敏感。未发现对哌拉西林和哌拉西林/他唑巴坦耐药的菌株，10 株菌株对哌拉西林中介率为20%（2/10），对哌拉西林/他唑巴坦中介率为10%（1/10）；对其余抗菌药物的耐药率分别为：左氧氟沙星60%（6/10）、环丙沙星70%（7/10）、氨曲南30%（3/10）、庆大霉素10%（1/10）、妥布霉素20%（2/10）。PA 对各种抗生素的耐药率，见表1。

表1 PA 对12 种抗生素的耐药率（n=10）Tab.1 Resistance rate of PA to 12 antibiotics（n=10）

2.2 PCR 产物电泳

对10 株菌株PCR 产物电泳显示，所有菌株均出现明显的OprD 条带，10 株菌株中有6 株OprD 的条带在1 500 bp 左右；而有4 株（P5、P6、P8、和P10）的OprD 电泳条带大概在1 000 bp 左右，推测这4 株菌株可能存在大片段的缺失。10株菌株电泳条带，见图1。

图1 10 株铜绿假单胞菌OprD 的扩增条带Fig.1 Amplified bands of OprD of 10 Pseudomonas aeruginosa strains

2.3 测序分析

10 株菌株经测序后与标准菌株PAO1 的序列比较分析后显示有不同的突变类型：有2 株菌株（P1 和P2）因碱基缺失导致移码突变；4 株菌株（P5、P6、P8 和P10）有大片段缺失，均为466～830 位点大片段缺失；2 株菌株（P3 和P9）提前出现终止密码子。10 株菌株的具体突变类型及突变特征，见表2。

表2 10 株铜绿假单胞菌OprD 基因突变分析Tab.2 Analysis of OprD gene mutation in 10 strains of Pseudomonas aeruginosa

3 讨论

10 株菌株药敏实验结果显示：除了对亚胺培南和美罗培南均表现为耐药，对头孢他啶、头孢吡肟均表现为敏感外，PA 对其余抗生素耐药率为0%～70%，与2019 年CHINET[5]所报道的耐药率4.6%～27.2%有较大差异，分析原因可能有以下2 点：（1）本研究在选择菌株时有要求，必须是Car-R/Ceph-S 的铜绿假单胞菌；（2）与参与本次研究的菌株数量少有关。这些可能原因需要在以后的研究中增加菌株数量予以验证。电泳结果显示10 株菌株均有明显的OprD 条带，未发现有OprD基因的完全缺失，这与李飞等[8]所报道的2.73%的缺失率有差异，可能是菌株数量少所致。

测序分析显示：在10 株Car-R/Ceph-S 的铜绿假单胞菌中OprD基因存在以下几种类型的突变模式：一种是点突变，导致过早出现终止密码子；第二种是移码突变，插入或缺失一个或多个核苷酸；最后一种是碱基片段的缺失。这与Lee JY 等[9]的报道相似。以往的研究报道[10]OprD基因的替换、缺失、插入或突变等变化可改变OprD 孔蛋白的构象或抑制其存在，并产生对碳青霉烯类抗生素的耐药性。Sherrard Laura J 等[11]也证实了OprD基因常见的突变都是导致PA 对碳青霉烯类抗生素耐药的重要因素。本研究中所有试验菌株均对亚胺培南和美罗培南耐药，对所有试验菌株的OprD基因序列分析显示：试验菌株的OprD基因中有碱基的缺失或突变，导致OprD基因中出现移码突变或终止密码子的提前出现，这与Hirabayashi 等[12]的研究一致。P4 菌株的OprD基因序列中有9 个氨基酸替代（T103S K115T F170L E185Q P186G V189T Q310E A315G G425A）与国内的研究[13-14]一致。与此外本研究也发现了一些新的氨基酸替代突变（D43N S57E S59R V127L V359L）。结合对10 株Car-R/Ceph-S 铜绿假单胞菌OprD基因的PCR 扩增结果和测序分析，笔者发现有4 株菌株（P5、P6、P8、P10）扩增后条带在1 000 bp 左右，测序后发现4 株菌株均有466～830 位点大片段缺失以及3 个氨基酸替代（S57E S59R V127L）；所以，笔者推测466-830 位点大片段缺失以及3 个氨基酸的替代可能是导致该表型的2 种重要突变，并且是同时发生的。在本研究中，有8 株菌株OprD基因序列都有氨基酸的替代突变，笔者推测，这种类型的突变可能导致OprD 孔蛋白的空间结构发生改变，从而导致耐药现象的出现。另外，有2 株菌株（P3、P9）因突变使得终止密码子（TGA）的提前出现。有研究[9]显示：在OprD基因中过早出现终止密码子可以抑制OprD 孔蛋白的存在，导致产生的OprD肽链异常缩短，OprD 孔蛋白功能丧失。大量研究表明这也是导致铜绿假单胞菌对碳青霉烯类（主要是亚胺培南）耐药的重要原因。

综上所述，OprD基因在Car-R/Ceph-S 的铜绿假单胞菌中起着重要作用；OprD基因的替换、缺失或插入突变等变化可改变OprD 孔蛋白的构象或抑制其存在，并产生对碳青霉烯类抗生素的耐药性。本研究发现在Car-R/Ceph-S 的铜绿假单胞菌中，OprD基因存在不同类型的突变，其中466～830 位点大片段缺失以及3 个氨基酸（S57E S59R V127L）的替代这两种同时出现的突变类型是有较大价值的，由于本次研究的菌株数量少，尚需进一步以大数量样本研究予以验证以及开展深入的耐药机制研究。此外，关于该特殊耐药表型的铜绿假单胞菌方面的研究较少，本研究结果可为此类型的研究提供参考。