道真县兔场兔球虫感染情况调查

李晓芸 ,程振涛

（1.道真仡佬族苗族自治县农业农村局，贵州 遵义 563500；2.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

兔球虫病是由艾美耳属的多种球虫寄生于家兔的肠道和肝脏所引起的一种原虫病，兔感染该病后主要症状为腹泻、消瘦，甚至死亡，为严重危害家兔的一种常见多发性疾病。不同品种、不同年龄段的兔均易感，其中，断奶至3月龄的幼兔最易发病，死亡率可达80%，患病耐过的兔生长发育受到严重影响，降低兔的生产性能，成年兔感染球虫后多数不发病而成为带虫兔[1]，该病的流行会给养兔业造成巨大的经济损失。据报道，兔球虫病目前已在国内广泛流行，JING 等[2]报道，全国14 个省兔球虫总感染率为41.9%；姜英等[3]调查发现，河南省11 个地区兔球虫平均感染率为74.6%；李洁等[4]发现，新疆5 个地区兔球虫总感染率为75.7%；任永军等[5]调查发现，四川省5 个地区兔球虫平均感染率为61%。目前公认的兔球虫种类有11 个有效种[6-7]，但不同地区优势虫种在一定程度上有所不同[3,5]，这与不同地区地理位置、气候条件等因素有关。PCR 技术具有特异性强、灵敏度高等优点，可准确鉴定出不同种类的兔球虫。目前，有关贵州省内兔球虫感染情况的研究较少。因此，对道真仡佬族苗族自治县2个兔场兔球虫感染情况和感染种类进行调查，以期为当地兔球虫病防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 兔粪便样品 来自于道真2 个不同兔场，分别位于平模镇顺河村、隆兴镇前进村，共77 份兔粪便。按照兔只存栏数5%的比例随机采集1～3月龄、3～6月龄和6月龄以上兔群新鲜粪便，每份粪便20 g 左右，每采1 份样品更换1次手套，装入洁净的一次性自封袋内，标记后带回实验室，置于4℃保存待检。

1.1.2 试剂 氯化钠（分析纯），福晨（天津）化学试剂有限公司；粪便基因组DNA 提取试剂盒，江苏康为世纪生物科技股份有限公司；2×Taq PCR Master Mix、DL 2000 DNA Maker均购自Takara公司。

1.1.3 主要仪器 生物显微镜（上海沪誉仪器有限公司）；PCR 仪（杭州柏恒科技有限公司）；电泳仪（北京六一仪器厂）；电泳凝胶成像仪（成都锦世昌祥科技有限公司）；麦氏虫卵计数板（中国农业科学院上海寄生虫病研究所）。

1.2 方法

1.2.1 兔球虫感染率及感染强度 称取兔粪便2 g，放入50 mL 烧杯中，加入适量水搅匀，经80 目网筛过滤，用少量水冲洗3～5 次滤网，将滤液转移至新的50 mL 离心管，2 500 r/min 离心10 min，弃去上清液，加入少量饱和盐水溶液将沉淀物搅匀，全部转入比色管，加饱和盐水至60 mL 处，静置10 min，用移液枪吸取液面粪液，注满麦氏虫卵计数板的2个计数室，将计数板置于显微镜的载物台上静置5 min 后在低倍（10×10）显微镜下观察球虫卵囊情况，计算球虫感染率及感染强度。每克粪便卵囊数（OPG）=2 个计数室中卵囊数的平均数×200。兔球虫感染强度判定标准：OPG＞10×104为严重感染；1×104≤OPG≤10×104为中度感染；OPG＜1×104为轻度感染。

1.2.2 兔球虫感染种类 每个兔场取4 份兔球虫阳性粪便样品进行PCR 测定，样本1～4来自顺河村兔场，样本5～8来自前进村兔场。

1）粪便基因组DNA 提取。使用粪便基因组DNA 提取试剂盒对兔球虫阳性粪便进行总DNA 提取，具体提取过程参照粪便基因组DNA提取试剂盒说明书。

2）PCR 扩增。根据GenBank 中公布的5 种兔艾美耳球虫参考虫株的基因序列，分别设计1对特异性引物，引物均由上海生工生物公司合成，引物信息见表1。以提取的总DNA 为模板，利用设计的特异性引物，构建PCR 反应体系50 μL 进行PCR 扩增（每个反应均添加阳性和阴性对照样品），PCR 产物在含Goldview 的1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

表1 兔艾美耳球虫PCR扩增引物信息

3）目的基因测序及分析。PCR 检测为阳性的基因片段送至上海生工生物公司进行测序，所得碱基序列上传NCBI进行同源性比对，根据序列核苷酸同源性鉴定艾美耳球虫的种类。

2 结果与分析

2.1 兔球虫感染情况

经饱和盐水漂浮法和显微镜观察，77 份兔粪便中有55 份检出兔球虫卵囊，总感染率为71.4%，感染强度为中度感染，调查的2 个兔场均不同程度感染球虫，感染具体情况见表2。不同年龄段兔感染球虫情况如表3 所示，1～3月龄幼兔感染率最高，达96.9%，且多呈中度或重度感染。

表2 不同兔场兔球虫感染情况

表3 不同年龄段兔感染球虫情况

2.2 目的基因PCR扩增结果

从图1～5 可知，PCR 扩增产物电泳后，穿孔艾美耳球虫、维氏艾美耳球虫和大型艾美耳球虫均与预期的球虫基因大小一致，而肠艾美耳球虫和小型艾美耳球虫均无条带出现，表明感染的兔球虫是穿孔艾美耳球虫、维氏艾美耳球虫和大型艾美耳球虫。

图1 兔场穿孔艾美耳球虫检测结果

图2 兔场维氏艾美耳球虫检测结果

图3 兔场小型艾美耳球虫检测结果

图4 兔场肠艾美耳球虫检测结果

图5 兔场大型艾美耳球虫检测结果

2.3 目的基因序列测定与分析结果

对所得碱基序列上传NCBI进行比对，结果表明，感染的兔球虫是穿孔艾美尔球虫、维氏艾美耳球虫和大型艾美耳球虫。将试验分离到的艾美耳球虫虫株分别命名为DZ-E.perforans、DZ-E.vejdovskyi、DZ-E.magna，并与艾美耳球虫参考虫株进行核苷酸同源性比对，结果显示，DZ-E.perforans与国内外E.perforans虫株同源性最高，为97.8%～99.8%，DZ-E.vejdovskyi与国内外E.vejdovskyi虫株同源性最高，为93.3%～94.7%，DZ-E.magna与国内外E.magna虫株同源性最高，为98.7%～99.0%。

3 小结与讨论

目前，兔球虫病是兔场最常见的寄生虫病，在规模化兔场和散养户均普遍存在。穆贞军等[8]调查贵阳市花溪区5 个兔场，兔球虫总感染率为81%。调查发现，道真兔场兔球虫总感染率为71.4%，感染率较高。道真县1～3月龄兔球虫总感染率为96.9%，明显高于其他年龄段兔，与欧阳昌勇等[9-10]的研究即兔球虫可感染不同年龄段兔，以断奶至3月龄兔感染率最高的结果一致。鉴定出大型艾美耳球虫、穿孔艾美耳球虫和维氏艾美耳球虫，这与陈红等[11]的研究即甘肃省5 个不同兔场鉴定出的3种优势虫种结果一致。

兔球虫病是养兔业中危害比较严重的一种兔病，对该病的防控需科学合理的药物防治，并结合饲养管理和有效的卫生消毒措施。一是加强饲养管理，饲喂营养成分均衡的饲料，增强兔群抵抗力，注意兔场卫生，粪便无害化处理，定期使用火焰消毒和消毒剂消毒；二是定期监测兔场球虫感染情况，根据感染情况变化科学合理用药，同时根据季节性的发生特征调整用药方案，在该病易爆发的季节可适当加大药物的预防剂量；三是做好病兔隔离治疗，及时彻底消毒。必要时为迅速扑灭疫病，可扑杀病兔。在实际生产中，很难做到彻底清除兔场内的球虫卵囊，但通过改善兔场内环境卫生条件、加强饲养管理和药物防治等措施尽可能降低兔群中球虫卵囊的数量，可很大程度上减少兔球虫病的发生，且兔群接受低剂量球虫卵囊感染可激发兔群产生免疫保护力。