广西地不容和地枫皮内生真菌对罗汉果土传病原真菌的抑制活性

冯蓓蓓， 邓业成， 卢丹丹， 汤夏安， 邓志勇， 骆海玉

(广西师范大学生命科学学院，广西桂林 541006)

罗汉果(Siraitiagrosvenorii)是葫芦科罗汉果属植物的果实，很早就被发现是药食两用的植物[1-2]。罗汉果植株的主要土传病害有根腐病[3-4]、白绢病[5]、青枯病[6]、根结线虫病[7]、芽枯病[8]等。研究发现，齐整小核菌(SclerotiumrolfsiiSacc.)是罗汉果白绢病的致病菌，通过侵害罗汉果的茎基部和根部，使罗汉果茎叶萎蔫，最后枯萎而死[9]。罗汉果根腐病的致病菌是镰刀菌根腐类病菌[10]，通过侵染罗汉果根部，使根腐烂，造成植株枯萎死亡。目前，化学防治是最广泛应用的防治方式，但人们越来越注重随之而来的环境、食品等问题，所以研究出更加科学安全的防治方法迫在眉睫。随着技术的发展和人们对杀菌剂要求的日益提高，农业病害的防治提倡采用更加安全、低污染的生物防治，所以植物内生真菌及其产生的抗菌物质成为植物病害防治相关研究的热门方向[11]。植物内生菌是不危害植物宿主，存在于健康宿主细胞间或细胞内的一大类未完全开发的微生物[11-13]。

广西地不容(Stephaniakwangsiensis)是中国特色千金藤属植物[14]，有着广泛的药用价值，比如清热解毒、消肿去瘀等[15]。目前对广西地不容的杀虫活性[16]和抑菌活性[17]等已有研究报道。地枫皮(Illiciumdifengpi)为木兰科八角属植物，具有丰富的药用价值，常用于风湿疼痛类疾病的治理，也是跌打损伤药品的主要药物原料[18]。

笔者所在课题组经过多年研究得出，广西地不容和地枫皮的内生真菌对多种植物病原真菌有抗菌活性[19-22]。基于此，进一步研究2种植物内生真菌对罗汉果3种土传病原真菌的抗菌活性，旨在为其在杀菌剂领域的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试植物内生真菌 广西地不容内生真菌：DBR-3、DBR-5、DBR-15；地枫皮内生真菌：DFP-G-5、DFP-G-7、DFP-G-9、DFP-P-7.1。上述内生真菌均由笔者所在实验室保存并提供的菌种中筛选取得，见表1。

1.1.2 供试罗汉果病原真菌 3株罗汉果病原真菌为GFB-G10、GFB-G15和BJB。上述病原真菌均由笔者所在实验室保存并提供的菌种中筛选取得，见表1。

表1 内生真菌和病原真菌种类

1.1.3 供试培养基和发酵液 菌株活化、制作大量培养基。拮抗试验培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA，含马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂25 g、蒸馏水1 L)。液体发酵培养基：马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB，含马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 L)。

1.2 试验方法

1.2.1 内生真菌发酵产物制备 所有试验在广西师范大学雁山校区珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室开展，时间为2021年1—5月。在无菌超净台内活化7种纯化好的植物内生真菌，在PDA 平板上培养3 d后使用。用 0.4 cm 打孔器在每种内生真菌菌落边缘打取菌饼。分别放入已准备好的灭菌PDB培养基中，每瓶放15个菌饼。放置于(27±1) ℃恒温培养箱中培30 d，每天振荡3次。

采用液-液萃取法分离出内生真菌发酵液中的粗提物，操作如下：首先，将内生真菌发酵液与之等体积的乙酸乙酯连续萃取3次，将萃取液合并，得到乙酸乙酯层和萃余层。然后，使用旋转蒸发器，分别得到发酵液乙酸乙酯萃取物以及发酵液萃余物的膏体。最后，将分离出的菌丝体烘干、碾碎后，用甲醇浸提[23]。反复多次浸提直至浸提液无色为止，每次浸提时间为2 d。通过抽滤把菌丝体与甲醇浸提液分开，使用旋转蒸发仪处理甲醇浸提液得到膏体，即菌丝体甲醇粗提物。

1.2.2 抑菌活性测定

1.2.2.1 内生真菌对罗汉果病原真菌的拮抗试验 在无菌超净台内使用平板对峙法[24-25]完成拮抗试验。操作如下：分别活化7种植物内生真菌和3种植物病原菌，培养3 d。在培养皿底面做记号，以培养皿直径画线，以圆心为对称点，2点之间间距 3 cm 取点，做标记。用直径为0.4 cm的打孔器分别在内生真菌和病原菌的菌落边缘打取菌饼，依次接种于标记的2点，并在培养皿底面写好对应的菌种名称。对照组除不接内生真菌外，其他与试验组相同，且处理组、对照组都做3个重复。于恒温箱(27±1 ℃)中培养1～9 d，同时每天观察菌丝生长速度、边缘菌丝是否变形、抑菌带是否产生等。测量每个菌落的半径，按照下面公式计算得出抑制率：

抑制率=(对照组菌落半径-处理组菌落短半径)/对照组菌落半径×100%。

1.2.2.2 发酵产物对罗汉果病原真菌菌丝生长的抑制活性测定 在无菌工作台中操作，使用菌丝生长速率法[26]完成活性的测定。首先将7株内生真菌的发酵液乙酸乙酯萃取物膏体、发酵液萃余物膏体及菌丝体粗提物膏体配制成质量浓度分别为20、100、100 g/L的药液，溶剂为丙酮，然后活化内生真菌和植物病原菌3 d。在9 cm直径的培养皿中同时加入1 mL药液(对照组药液用丙酮代替，其他与处理组相同) 与9 mL热熔的PDA培养基，轻微晃动使其混合均匀，制成带药培养基(质量浓度分别为：2、10、10 g/L)。用直径为0.4 cm的打孔器分别在3种罗汉果病原真菌的菌落边缘打取菌饼。菌饼贴于之前做好的已凝固带药培养基上，且菌饼成“品”字排列[白绢病菌病原菌(BJB)的对照组除外，由于BJB生长速度过快，因此BJB的对照组每皿只接1个菌饼]，在恒温培养箱(27±1 ℃)中培养3 d。BJB的对照组重复3次。使用十字交叉法[27]测量每个菌落的直径，按照下面公式计算得出抑制率：

抑制率=(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落直径-0.4)×100%。

配制一系列质量浓度的带药培养基，计算得出各个质量浓度的抑菌率。用最小二乘法求出毒力回归方程、相关系数(r) 、有效中浓度(EC50)及EC50的95%置信限。

2 结果与分析

2.1 植物内生真菌对罗汉果病原菌的拮抗活性

由表2可知，7种植物内生真菌对3种罗汉果病原真菌有不同程度的抑制效果。其中DBR-15对GFB-G10和GFB-G15的拮抗作用最大，抑制率达到60.00%～70.77% 。DFP-G-9对GFB-G10的拮抗作用最小，抑制率只有2.86% 。

表2 7株内生真菌对3种罗汉果病原真菌的拮抗活性

2.2 植物内生真菌发酵产物对罗汉果病原真菌的抑制活性

2.2.1 2 g/L植物内生真菌发酵液乙酸乙酯萃取物对罗汉果病原真菌的抑制活性 如表3所示，6种植物内生真菌DBR-3、DBR-5、DBR-15、DFP-G-7、DFP-G-9、DFP-P-7.1的发酵液乙酸乙酯萃取物对3种病原菌抑菌活性好(除DBR-15对GFB-G10的抑菌活性一般)，抑制率均大于50%。DFP-G-5发酵液乙酸乙酯萃取物抑菌活性差，抑制率均小50%。根据此结果，接下来研究2种罗汉果内生真菌(DBR-3、DBR-5)、3种地枫皮内生真菌(DFP-G-7、DFP-G-9、DFP-P-7.1)的发酵液乙酸乙酯萃取物对3种罗汉果病原真菌的毒力和DBR-15的发酵液乙酸乙酯萃取物对 GFB-G15、BJB的毒力。

表3 7株内生真菌发酵液乙酸乙酯萃取物对3种罗汉果病原真菌菌丝的抑制活性

2.2.2 10 g/L植物内生真菌发酵液萃余物对罗汉果病原真菌的抑制活性 如表4所示，4种植物内生真菌DBR-5、DFP-G-5、DFP-G-7、DFP-P-7.1的发酵液萃余物对BJB的抑菌活性好，抑制率均大于50%。其他植物内生真菌的发酵液萃余物对罗汉果病原真菌抑菌活性差，抑制率均小于50%。得出结论，这7种植物内生真菌的发酵液萃余物对3种罗汉果病原真菌几乎没有抑制活性。可以确定，抑菌物质主要存在于这7种植物内生真菌的发酵液乙酸乙酯萃取物中。根据此结果，接下来研究4种内生真菌DBR-5、DFP-G-5、DFP-G-7、DFP-P-7.1的发酵液萃余物对BJB的毒力。

表4 7株内生真菌发酵液萃余物对3种罗汉果病原真菌菌丝的抑制活性

2.2.3 10 g/L植物内生真菌菌丝体甲醇提取物对罗汉果病原真菌的抑制活性 如表5所示，DBR-5的菌丝体甲醇粗提物对3种病原菌的抑菌活性较好，抑菌率均大于70%。DBR-15、DFP-G-9的菌丝体甲醇粗提物对GFB-G10、BJB的抑菌活性好，抑菌率均大于50%。DFP-P-7.1的菌丝体甲醇粗提物对GFB-G15、BJB菌丝的抑菌活性好，抑菌率均大于50%。DBR-3的菌丝体甲醇粗提物对GFB-G15的抑菌活性好。DFP-G-7的菌丝体甲醇粗提物对BJB的抑菌活性好。DFP-G-5菌丝体甲醇提取物抑菌活性差，抑菌率均小于50%。根据此结果，接下来研究DBR-5的菌丝体甲醇提取物对3种罗汉果病原真菌的毒力，DBR-15、DFP-G-9的菌丝体甲醇粗提物对 GFB-G10、BJB的毒力，DFP-P-7.1的菌丝体甲醇粗提物对GFB-G15、BJB的毒力，DBR-3的菌丝体甲醇粗提物对GFB-G15的毒力，DFP-G-7的菌丝体甲醇粗提物对BJB的毒力。

2.3 广西地不容内生真菌发酵产物对罗汉果病原真菌的毒力

为进一步确定广西地不容内生真菌发酵产物的抑菌效果，根据上文抑菌活性测定结果，选取3株地不容内生真菌DBR-3、DBR-5、DBR-15的发酵液乙酸乙酯萃取物、发酵液萃余物、菌丝体甲醇提取物对罗汉果原真菌抑菌率达到50%以上的相应病原菌作为供试菌株，进一步测定其对供试菌株菌丝的毒力，结果见表6。3种病原菌中，DBR-3的发酵液乙酸乙酯萃取物对GFB-G10的毒力最高，EC50为 0.334 0 g/L；对BJB的毒力最低，EC50为1.064 5 g/L。DBR-5的发酵液乙酸乙酯萃取物对BJB的毒力最高，EC50为0.120 8 g/L；对GFB-G10的毒力最低，EC50为0.379 9 g/L。DBR-15发酵液乙酸乙酯萃取物对BJB的毒力比对GFB-G15的毒力高。DBR-5的菌丝体甲醇提取物对GFB-G15的毒力最高，EC50为0.270 8 g/L；对GFB-G10的毒力最低，EC50为0.957 8 g/L。DBR-15的菌丝体甲醇提取物对BJB的毒力比对GFB-G10的毒力高。

表5 7株内生真菌菌丝体甲醇提取物对3种植物病原真菌菌丝的抑制活性

2.4 地枫皮内生真菌发酵产物对罗汉果病原真菌的毒力

为进一步确定地枫皮内生真菌发酵产物对3种罗汉果病原真菌菌丝生长的抑制活性， 根据上文抑菌活性测定结果，选取4株地不容内生真菌DFP-G-5、DFP-G-7、DFP-G-9、DFP-P-7.1的发酵液乙酸乙酯萃取物、发酵液萃余物、菌丝体甲醇提取物对罗汉果原真菌抑菌率达到 50%以上的相应病原菌作为供试菌株，进一步测定其对供试菌株菌丝的毒力，结果见表7。3种病原菌中，DFP-G-7、DFP-P-7.1的发酵液乙酸乙酯萃取物对BJB的毒力最高，EC50分别为0.172 4、0.186 1 g/L；对GFB-G15的毒力最低，EC50分别为2.911 7、0.878 9 g/L。DFP-G-9的发酵液乙酸乙酯萃取物对BJB的毒力最高，EC50为0.426 9 g/L；对 GFB-G10 的毒力最低，EC50为1.545 4 g/L。DFP-G-9 菌丝体甲醇提取物对BJB的毒力比对GFB-G10的毒力高。DFP-P-7.1菌丝体甲醇提取物对BJB的毒力比对GFB-G15的毒力高。

表6 广西地不容内生真菌发酵产物对3种罗汉果病原真菌的毒力

表7 地枫皮内生真菌发酵产物对3种罗汉果病原真菌的毒力

3 讨论与结论

目前对地枫皮内生真菌的研究较少，已知地枫皮的根、茎、叶中具有大量的内生真菌[28]，其中一些内生真菌对植物病原菌和动物病原菌有较为广泛的抑菌性，所以研究广西特色植物地枫皮的有利于抗菌植株的培养和生物抗菌剂的研发。

目前对广西地不容内生真菌的研究已初具规模，研究发现其块茎中有多种内生真菌具有很强的抗菌性且有较强的普适性[29]。现已有以广西地不容为原料的生物杀菌剂研发。

随着罗汉果种植的加大，如何防治罗汉果土传病害成为当务之急。目前大多用化学防治，但是随后带来的环境污染不可忽略。所以对罗汉果土传病害的生物杀菌剂的研发迫在眉睫。

在拮抗试验中供试广西地不容和地枫皮内生真菌对3种罗汉果病原真菌有抑制活性普遍偏低。为了节省时间，减少不必要的步骤， 先要初步判断7种植物内生真菌对3种病原真菌是否有抑菌活性，所以采用了平板对峙法。但拮抗试验中抑制效果不好的菌株并不能说明其没有抑菌活性，可能是本试验方法的局限性造成的，比如由于培养时间太短，抑菌物质尚未产生等。所以应该进一步测定内生真菌发酵产物对病原真菌的抑制活性，从而筛选优良的抑菌菌株。

有大量的研究证明，植物内生菌发酵产物的乙酸乙酯萃取物有广泛的抑菌活性[27-29]。本试验结果也显示，6种植物内生真菌DBR-3、DBR-5、DBR-15、DFP-G-7、DFP-G-9、DFP-P-7.1的发酵液乙酸乙酯萃取物具有很好的抑菌活性，在质量浓度为2 g/L时，其对3种罗汉果病原真菌BJB、GFB-G10、GFB-G15的抑制率均在50% 以上(除DBR-15发酵液乙酸乙酯萃取物对GFB-G10的抑菌活性一般)，其中DBR-5的发酵液乙酸乙酯萃取物对BJB的毒力最高，EC50为0.120 8 g/L。

这6种植物内生真菌的菌丝体甲醇提取物对病原菌的抑制活性一般，质量浓度为10 g/L时，对3种罗汉果病原真菌其中的一种或多种的抑制率均在50%以上，其中DBR-5的菌丝体甲醇提取物对GFB-G15的毒力最高；EC50为0.270 8 g/L。

4种植物内生DBR-5、DFP-G-5、DFP-G-7、DFP-P-7.1的发酵液萃余物对病原菌的抑制活性一般，质量浓度为10 g/L时，对BJB的抑菌率在50%以上，其中DBR-5的发酵液萃余物对BJB的毒力最高，EC50为1.488 1 g/L。

6种植物内生真菌DBR-3、DBR-5、DBR-15、DFP-G-7、DFP-G-9、DFP-P-7.1的发酵产物乙酸乙酯萃取物有较好的抗菌活性，有很大的研究价值与潜在价值，可以推进研究这6种植物内生真菌，探究其活性物质的组成。