饮水中添加复合酶对黄羽肉鸡生长性能、血清抗氧化指标、免疫功能和肠道结构的影响

■陈鑫珠 杨雅妮，2 邱水玲，2 靳伟刚 李忠荣* 邱华玲 林海虹 刘 景

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建省畜禽遗传育种重点实验室，福建福州 350013；2.福建农林大学，福建福州 350001；3.福建福大百特生物科技有限公司，福建福州 350007；4.酶高效表达国家工程实验室，福建福州 350007）

动物对饲料养分的消化、吸收受饲料中诸多抗营养因子的影响，如植酸、非淀粉多糖、蛋白酶抑制因子等[1-2]，添加酶制剂可增强机体内源性酶的活性[3-5]，合理使用酶制剂能够降解饲料抗营养因子，提高日粮蛋白质利用率，维持肠道微生态平衡，促进肠道健康[6]，提高动物生产性能[7-8]。应用于饲料的酶制剂产品种类繁多，性质差异较大，因此在动物中的研究结果不尽相同[9-10]。蛋白酶在动物中的利用研究报道较多[11-12]。李东东等[9]研究表明，添加外源蛋白酶可提高饲料养分（尤其是蛋白质和氨基酸）的消化率。蛋白酶在禽类中的应用较为广泛，因为禽类的消化道比较短，通过添加酶制剂可以有效地消化饲料中的营养物质，提高利用率和生产性能[13-14]。碳水化合物氧化酶、己糖氧化酶和生物活性肽等因技术或原料限制，早期成本较高，资源有限，在动物应用中报道较少。不同酶单体特性存在差异，对畜禽的应用效果不同，因此养殖中更趋向添加复合酶[15-16]。但不同单体因其特有的生物学特性，进行复合时也可能存在相互影响而达不到相乘的效果，因此，在了解酶的特性同时，必须以动物试验作为最终判定依据。另外，酶制剂添加方式主要是饲粮添加和饮水添加，然而饲粮加工过程中通常存在高温工艺导致酶失活以及混合不均匀等问题，饮水添加则能很好地解决了这些问题。本试验通过饮水途径添加复合酶，探究2种不同复合酶对黄羽肉鸡生长性能、血清抗氧化指标、免疫功能和肠道结构的影响，为复合酶在黄羽肉鸡上的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

复合酶：复合酶A是由芽孢杆菌产生的一种复合酶，主要含蛋白水解酶（酶活≥8 000 U/g）、半纤维素酶类（酶活≥8 000 U/g）；复合酶B 是由黑曲霉产生的一种复合酶，主要含己糖氧化酶（酶活≥2 000 U/g）、生物活性肽等。以上2 种复合酶由福建某生物科技有限公司提供。

黄羽肉鸡：新兴黄鸡苗，购自莆田温氏家禽农牧有限公司。

1.2 试验设计

5 000 羽1 日龄温氏黄羽肉鸡统一育雏至29 日龄，选取4 000羽随机分为5组，每组4个重复，每重复200 羽（公母各半），各重复初始平均体重差异不显著（P＞0.05）。对照组饮水中不添加复合酶，试验1、2 组饮水中分别添加50、100 mg/L复合酶A，试验3、4组饮水中分别添加125、175 mg/L 复合酶B。对照组、试验组饲喂相同日粮（日粮中未添加酶制剂），试验期40 d，试验设计见表1。

表1 试验设计

1.3 试验日粮

参考《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)营养需要推荐量和《温氏新兴黄鸡饲养手册》等，配制29～45、46～70日龄阶段日粮，试验日粮组成与营养水平见表2。

表2 试验日粮组成与营养水平（风干基础）

1.4 饲养管理

试验采用封闭式鸡舍垫料平养，舍内设置自动料线、自动饮水线，自由采食颗粒饲料、充足饮水。按《黄羽肉鸡饲养管理手册》进行日常管理和免疫等，记录试验期间疫苗接种情况、疾病发生及治疗情况。

1.5 生长性能测定

以重复为单位，测定各重复29日龄、70日龄空腹平均体重，每天记录各重复饲料消耗量，计算各重复的平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）及料重比（F/G）。

1.6 样品采集与指标测定

于70 日龄（禁食12 h 后）每重复随机选取2 只健康、接近平均体重的鸡2只（公母各1只），称取活重后进行血清制备。颈部放血处死，立即摘取脾脏、法氏囊、胸腺以及肠道组织，按以下方法进行样品制备及指标测定。

1.6.1 血清制备与指标测定

翅静脉采血5 mL，4 ℃冰箱静置60 min、3 000 r/min离心10 min，取上清液分装于1.5 mL 冷冻管，-20 ℃冷冻保存备测。采用UNICO-UV2000型分光光度计，按各指标试剂盒测定方法，分别测定血清总蛋白（TP）、超氧化物歧化酶（SOD）、羟自由基（·OH）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、超氧阴离子自由基（·O2-）及溶菌酶（LZM）活性。采用酶标仪（DG5033A 型）法测定血清中的白蛋白（ALB）和免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）。试剂盒购自上海科艾博生物技术有限公司。

1.6.2 免疫器官采集与测定

剖开胸腹腔，摘取内脏后依次采集脾脏、法氏囊、胸腺并逐一称重、记录，按以下公式计算免疫器官指数。胸腺称重后立即放入液氮中保存备用，按各指标试剂盒测定方法分别测定胸腺中白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。试剂盒购自上海科艾博生物技术有限公司。

免疫器官指数（g/kg）=免疫器官鲜重（g）/宰前空腹活体重（kg）

1.6.3 肠道组织采集与指标测定

分别剥离十二指肠、空肠、回肠，进行称重、测量长度。分别截取长度约1 cm 十二指肠、空肠和回肠中段，用生理盐水将内容物冲洗干净后，放入甲醛固定液中固定。固定状态良好后，严格按照病理检测SOP程序进行修剪、脱水、包埋、切片、染色、封片。使用Eclipse Ci-L（Nikon）拍照显微镜对组织目的区域进行40 倍成像，成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0分析软件，分别测量每张切片上5根完整肠绒毛高度（mm)、5处隐窝深度（mm）和5处黏膜层厚度（mm）。

1.7 数据统计

用Excel 软件对试验数据进行初步统计，采用SPSS 19.0 统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan’s 多重比较，结果以“平均值±标准差（Mean±SD）”表示。P＞0.05 为差异不显著，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 复合酶对29～70日龄黄羽肉鸡生长性能的影响

由表3可见，试验组70日龄平均体重均显著大于对照组（P＜0.05），29～70 日龄平均日增重显著高于对照组（P＜0.05），料重比显著低于对照组（P＜0.05）。试验组与对照组平均日采食量差异不显著（P＞0.05）。试验1、2组之间，试验3、4组之间，即同种酶制剂的不同添加水平之间无显著（P＞0.05）差异。

表3 复合酶对29～70日龄黄羽肉鸡生长性能的影响

2.2 复合酶对黄羽肉鸡血清抗氧化指标的影响

由表4可知，试验2、3、4组70日龄血清羟自由基含量均显著高于对照组（P＜0.05）；试验2 组超氧化物歧化酶活性显著低于对照组（P＞0.05）。各试验组与对照组血清DPPH 自由基和超氧阴离子自由基含量差异不显著（P＞0.05）。添加相同复合酶条件下，试验2组羟自由基显著高于试验1 组；试验4 组显著高于试验3 组（P＜0.05）。试验1 组血清DPPH 自由基含量高于其他各组，其中显著高于试验4组（P＜0.05）。

表4 复合酶对黄羽肉鸡血清抗氧化指标的影响

2.3 复合酶对黄羽肉鸡免疫功能的影响

由表5可知，试验4组70日龄血清免疫球蛋白A含量、免疫球蛋白M含量和溶菌酶活性显著高于对照组（P＜0.05），试验2组血清白蛋白含量显著高于试验4组（P＜0.05）。试验组与对照组血清总蛋白、免疫球蛋白G、胸腺指数、法氏囊指数、脾脏指数、胸腺中白细胞介素-1β、白细胞介素-6、白细胞介素-8及肿瘤坏死因子-α等免疫指标均差异不显著（P＞0.05）。除试验4组的溶菌酶活性显著（P＜0.05）高于试验3组外，其余指标，同种酶制剂不同添加剂量之间均无显著差异（P＞0.05）。

表5 复合酶对黄羽肉鸡免疫功能的影响

2.4 复合酶对黄羽肉鸡肠道结构的影响

由表6可知，各试验组与对照组十二指肠长度和隐窝深度无显著差异（P＞0.05）；试验4 组十二指肠肠重量、肠绒毛高度、黏膜层厚度和肠绒毛高度/隐窝深度显著高于对照组（P＜0.05）。各试验组与对照组空肠长度和肠绒毛高度/隐窝深度等均无显著差异（P＞0.05），试验1组空肠肠绒毛高度和黏膜层厚度、试验2组肠绒毛高度、试验2 组和试验4 组肠隐窝深度均显著高于对照组（P＜0.05）。各试验组与对照组回肠长度、肠绒毛高度、隐窝深度、肠绒毛高度/隐窝深度、黏膜层厚度等均无显著差异（P＞0.05），试验4 组回肠重量显著高于对照组（P＜0.05）。

3 讨论

由于机体内源酶分泌不足，应用外源性酶制剂补充内源酶的不足越来越受到重视[17-18]。特别在幼龄动物，饲料配方中添加外源性酶，可以有效促进其对饲料的消化吸收，降低饲料中的抗营养因子，提高平均日增重，降低料重比，降低营养性腹泻发生率[19]。然而，随着工艺的发展以及对酶特性的研究，不同酶的特异性组合，具有相乘效果，且降低成本[20]。王明海等[21]报道，玉米-豆粕型日粮中添加复合酶制剂，可以显著提高肉仔鸡蛋白质的消化率。本试验复合酶A主要成分为蛋白酶，蛋白酶是机体蛋白质消化和吸收的关键酶。王旭等[22]报道，黄羽肉鸡基础日粮中添加适量蛋白酶制剂，降低了肉鸡平均日采食量和料重比，提高了日粮中蛋白质及氨基酸的消化利用率，促进肉鸡对饲料中蛋白质、糖类物质的消化分解，最适添加量为200 mg/kg。为探索性价比更高的添加方式，本试验采用了饮水方式供给，复合酶的添加剂量均小于200 mg/kg。

酶制剂降解底物后产生一定量的活性物质，这些物质在动物机体中可能起到抗氧化、增强免疫等功能[23-24]。本试验中，肉鸡的血清抗氧化指标，试验2 组的超氧化物歧化酶活性显著低于对照组；试验4组羟自由基含量显著高于试验2 组；试验4 组的DPPH·清除能力显著低于试验1组。说明复合酶A和复合酶B 在这两方面均有一定的功能，其中复合酶B 效果更佳。这可能是复合酶B中含有生物活性肽等物质，可对机体抗氧化活性和免疫功能起直接作用，因此效果较佳。

幼龄动物的消化系统发育不全，酶分泌量不足而导致的腹泻、消化不良等，通过外源添加酶制剂获得改善，免疫力提高[25]。本试验中，试验4组的免疫球蛋白A、免疫球蛋白M 含量和溶菌酶活性显著升高，试验2 组的超氧化物歧化酶活性显著降低。这与孙颢轩等[26]、周梁等[27]在肉鸡上的研究结果相似。周梁等[27]报道，蛋白酶能够促进肉仔鸡生长前期的小肠发育，提高蛋白质及大部分氨基酸表观消化率，从而改善生长性能。Xu等[28]报道，日粮中添加酶制剂可改善其肠道形态，21 日龄肠绒毛高度、肠绒毛高度与隐窝深度比值显著增加，十二指肠、空肠、回肠的隐窝深度极显著降低，42 日龄空肠肠绒毛高度、绒毛高度与隐窝深度比值显著增加，隐窝深度显著降低。随着蛋白酶添加水平的提高，8～21日龄肉鸡十二指肠和空肠的隐窝深度呈显著线性升高，十二指肠的绒毛高度/隐窝深度呈显著线性降低，空肠绒毛高度呈显著二次曲线升高[26]。本试验亦获得相似结果，复合酶处理黄羽肉鸡的肠道形态均得到改善，试验1组空肠的肠绒毛高度和黏膜层厚度显著升高，试验2组空肠的肠绒毛高度和隐窝深度显著升高，试验4组十二指肠的肠绒毛高度、黏膜层厚度和绒毛高度/隐窝深度均显著升高，空肠的隐窝深度显著升高。

目前，添加剂的使用方式有饮水型与饲粮型，当前较多研究集中在饲粮型添加方面，在饮水型方面的研究较少，两种方式的应用效果报道也不完全一致。余建等[29]研究表明，饲粮与饮水添加酸化剂均能提高肉鸡生长性能，降低肉鸡消化道的pH，且饮水添加酸化剂效果要优于饲粮添加酸化剂。沈一茹等[30]报道，饲粮添加和饮水添加酸化剂对肉鸡生长性能的促进作用与抗生素相当，对肠道发育的促进作用优于抗生素，然饲粮添加对肉鸡生长性能和肠道发育的改善作用优于饮水添加。小剂量添加剂饲粮添加容易产生混合不均匀等问题，饮水添加则能很好地解决这些问题。徐静等[31]报道，饮水中添加0.06 mL/L 大蒜精油能够改善蛋鸡肠道组织形态，增加有益菌的定植，提高蛋鸡的生长性能。另外，饮水添加可以避免饲料生产过程当中加工条件对酶的影响，更适宜于在养殖现场中进行应用推广[32]。荆新堂等[32]报道，肉鸡饮水中全程按100 U/L 添加葡萄糖氧化酶，可提高肉鸡的生长性能，增加养殖经济效益。复合酶A和复合酶B在前期进行过饲粮添加，效果与本次饮水添加效果一致，但饮水量未做记录，无法进行添加剂量对比分析，后期将对饮水添加与饲粮添加进行进一步的对比分析试验。

4 结论

综上所述，添加复合酶A和复合酶B均可显著提高黄羽肉鸡的生长性能，复合酶B可以提高黄羽肉鸡血清抗氧化功能和免疫功能，改善十二指肠及空肠结构，推荐饮水添加剂量以125 mg/L为宜。