丙二酸盐克罗诺杆菌PspA包涵体蛋白的表达、复性及纯化方法优化

蒋秀婷,凌 娜,叶应旺

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

丙二酸盐克罗诺杆菌(Cronobactermalonaticus)是一种常存于动物体及人体肠道内的食源性致病菌,隶属于克罗诺杆菌属(Cronobacter.spp)[1],对干燥、热、酸、碱及抗生素等极端条件具有一定的耐受性[2]。婴幼儿配方奶粉(powdered infant formula,PIF)是克罗诺杆菌的主要传播媒介,研究表明在长达2.5 a的干燥过程中,接入奶粉中的27株肠杆菌只有克罗诺杆菌可被重新复苏[3],而食用了克罗诺杆菌的污染奶粉的婴幼儿极易患脑膜炎、败血症或坏死性小肠结肠炎等疾病[4],致死率最高达80%[5]。

热应激、干燥渗透失衡、乙醇、跨膜蛋白缺陷以及过量产生某种膜蛋白(如分泌素)等环境胁迫会导致细胞质膜完整性受损[6],而噬菌体休克蛋白(phage shock protein,Psp)系统则是一种存在于革兰氏阴性菌的胞外应激反应,能够防止压力条件下质子动力(proton motive force,PMF)的消散,维持细胞存活以及细胞质膜的完 整性[7]。PspA是一种外周细胞膜蛋白,有研究称其可通过直接的物理作用在细胞膜上形成PspA-PspF复合物[8],抑制PspF的ATP酶活性和psp基因的转录来实现负调控[9]。当细胞膜受到刺激时,PspB-PspC复合物检测到诱导触发因子[10],导致PspA将PspF从细胞膜释放到细胞质中,激活Psp系统的转录以缓解环境胁迫下对细胞造成的损害[11]。

目前,国内外对PspA蛋白的研究大多集中于大肠杆菌[12]、霍乱弧菌[13]等革兰氏阴性菌中,而在丙二酸盐克罗诺杆菌中该蛋白的结构功能、作用机理及蛋白互作情况仍处于起步阶段。本课题组前期研究发现PspA蛋白与丙二酸盐克罗诺杆菌耐受干燥应激有关,因而本研究采用基因工程的方法构建了PspA大肠杆菌表达载体,并探讨了PspA蛋白包涵体胞外复性、纯化的方法,为研究PspA蛋白在丙二酸盐克罗诺杆菌环境胁迫下的调控机制提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 质粒与菌株

表达载体pGEX-4T-1、丙二酸盐克罗诺杆菌(Cronobactermalonaticus)保藏于广东省微生物研究所;大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)DH5a、E.coliBL21 菌株购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.2 酶与试剂

高保真DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)购于Takara公司;T4连接酶、BamHⅠ、SalⅠ限制性内切酶均购于New England Biolabs公司;LB肉汤培养基、LB琼脂培养基、氨苄青霉素(ampicillin,Amp)、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、Mag-Beads GST 融合蛋白纯化磁珠、细菌基因组DNA 抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒、质粒DNA小量抽提试剂盒、GeLRed核酸染料、DL2000/1 kbp DNA Marker、低分子量预染型蛋白Marker、Tris-HCl缓冲液、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、BCA法微量蛋白质浓度测定试剂盒、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)、氧化型谷胱甘肽(glutathione oxidized,GSSG)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、精氨酸(l-Arginine,L-Arg)、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)均购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 仪器与设备

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增仪、BIO-RAD电泳仪(伯乐生命医学产品有限公司)、温金属浴(北京天根生化科技有限公司)、电热恒温培养箱(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)、恒温培养振荡器(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、超低温冰箱(惠而浦(中国)股份有限公司)、高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 目的基因的扩增

以阪崎克罗诺杆菌基因组DNA为模板,根据GenBank中已存在的pspA基因cDNA、基因组序列和原核表达载体pGEX-4T-1质粒图谱设计两端分别含有BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,其序列见表1所列。表1中,下划线为酶切位点。

表1 引物序列

PCR反应体系为50 μL,分别为Taq DNA聚合酶25 μL,上、下游引物各1 μL,模板DNA 1 μL,灭菌蒸馏水22 μL,低速离心混匀后放至PCR仪中,95 ℃预变性5 min,95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min,共30个循环,72 ℃再延伸5 min,最后12 ℃储存。PCR产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定,切下符合预期大小的目的片段,使用DNA胶回收试剂盒纯化。

1.2.2 重组质粒表达载体的构建与鉴定

分别将所获得的pspA基因目的片段与pGEX-4T-1载体通过限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切,37 ℃反应30 min,经1.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收纯化基因片段与载体。两者通过T4连接酶在25 ℃下混合4 h,获得重组表达载体pGEX-4T-1-PspA。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态菌,转化产物涂布于含Amp (最终质量浓度为0.1 g/L)的LB琼脂培养基中,30 ℃过夜培养。在生长菌落中挑取数个单克隆菌落进行鉴定,将获得符合预期条带大小的菌落接种至含氨苄青霉素的LB液体培养基中扩大培养,提取质粒DNA送至擎科(南京)生物科技有限公司进行测序,经测序鉴定正确后将该重组质粒命名为pGEX-4T-1-PspA进行冻存,并转化至E.coliBL21感受态菌进行后续操作。

1.2.3 重组蛋白的诱导表达

将经鉴定的重组BL21-pspA菌株接种于含Amp(最终质量浓度为0.05 g/L)的LB液体培养基中,37 ℃培养至对数中期时,加入0.1 mol/L的IPTG至终浓度为1.0 mmol/L进行诱导表达,4 h后4 000 r/min离心培养液,弃上清。配制含PBS和PMSF的细菌蛋白裂解液重悬沉淀,并进行15 min超声破碎后,4 ℃、12 000 r/min离心20 min,经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测上清液和沉淀中目标蛋白表达情况。

1.2.4 包涵体的复性

包涵体沉淀使用含8 mol/L尿素的0.1 mol/LTris-HCl缓冲液中重悬并超声破碎,12 000 r/min离心后取上清,采取以下4种方法进行复性。

(1) 方法1。称取3.1 g DTT溶于1 L的0.02 mol/L的PBS缓冲液中,菌体湿重称重后按比例(1∶15)加入新配制的复性液,4 ℃过夜,12 000 r/min离心20 min取上清保存。

(2) 方法2。配制含2 mmol/L GSH和0.2 mmol/L GSSG的Tris-HCL复性缓冲液,按比例(1∶15)缓慢加入新配制的复性液,室温孵育4～6 h后,4 ℃、12 000 r/min离心20 min取上清保存。

(3) 方法3。按相应浓度配制包涵体复性缓冲液:0.1 mol/L Tris-HCL、15%甘油、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L GSH、1 mmol/L GSSG、0.5 mol/L L-Arg、1% PMSF、pH值8.5。按比例(1∶10)逐滴加入配制好的复性缓冲液,缓慢搅拌后注入透析袋中,密封放置于PBS中,4 ℃透析48 h,每隔12 h更换透析缓冲液。将透析袋包埋在蔗糖与聚乙二醇粉末中1 h,对蛋白溶液进行浓缩,4 ℃、12 000 r/min离心20 min取上清保存。

(4) 方法4。按相应浓度配制包涵体复性缓冲液:0.1 mol/L Tris-HCL、15%甘油、0.1 mol/L NaCl、1 mmol/L GSH、1 mmol/L GSSG、0.5 mol/L L-Arg、1% PMSF、pH值8.5。按比例(1∶10)逐滴加入配制好的复性缓冲液,装入透析袋中放置于6 mol/L尿素中4 ℃透析12 h,后按6、4、3、2、1、0 mol/L的尿素浓度更换透析缓冲液进行梯度透析。将透析袋包埋在蔗糖与聚乙二醇粉末中1 h,对蛋白溶液进行浓缩。4 ℃、12 000 r/min 离心20 min取上清保存。

1.2.5 融合蛋白的纯化

取所获得的蛋白上清液,使用Mag-Beads GST 融合蛋白纯化磁珠进行纯化,洗脱样品经BCA试剂盒和SDS-PAGE鉴定纯化效率。采用超滤透析对目的蛋白进行浓缩,得到高浓度的GST-PspA融合蛋白。

2 结果与分析

2.1 目的基因扩增及表达载体构建与鉴定结果

目的基因pspA经琼脂糖凝胶电泳分析,结果如图1所示。

图1 pspA基因的克隆

由图1可知，1 000 bp左右处有符合pspA基因672 bp大小的特异性条带,表明成功扩增出pspA基因目的片段。将PCR产物和pGex-4T-1质粒分别用BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶进行双酶切。凝胶回收双酶切产物连接转化E.coliDH5α感受态菌后,挑取阳性克隆进行DNA测序分析,结果如图2所示。

由图2可知，酶切产物与GenBank数据库中pspA基因片段大小完全一致,且含有BamHⅠ和SalⅠ双酶切位点,表明pGex-4T-1-PspA原核表达载体构建成功。

图2 DH5α-pspA原核载体的构建分析

2.2 重组BL21-pspA菌株的诱导表达

前期扩增的pspA序列长度为672 bp,共编码223个氨基酸,其蛋白分子量约为25 kDa,GST标签蛋白分子量26 kDa,因此诱导表达的GST-PspA融合蛋白的分子量约为51 kDa。将pGex-4T-1-pspA重组质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21,1.0 mmol/L的IPTG诱导融合蛋白表达,以不添加 IPTG的表达菌株作为阴性对照,SDS-PAGE 检测蛋白表达情况,结果如图3所示。图3中:M为蛋白Marker;1为阴性对照;2为蛋白上清液;3为包涵体蛋白。由图3可知，当IPTG浓度为1.0 mmol/L时,泳道2中上清液目的蛋白有略微提高,但泳道3显示诱导后在51 kDa处有大量的目的融合蛋白,表明重组BL21-pspA菌株所表达的蛋白多为不可溶的无生物活性的包涵体。

图3 重组 PspA蛋白SDS-PAGE分析

2.3 包涵体蛋白的复性与纯化

经4 ℃过夜梯度透析复性后,用Mag-Beads GST 融合蛋白纯化磁珠纯化融合蛋白,经洗脱液多次洗脱,SDS-PAGE检测蛋白纯化情况如图4所示。图4中:M为蛋白Marker;A为方法1;B为方法2;C为方法3;D为方法4。

由图4可知，51 kDa处存在单一条带,且亮度最高,融合蛋白有效表达且成功纯化。通过BCA试剂盒检测可知,方法1、方法2获得约0.02 mg的GST-PspA融合蛋白,方法3获得约0.4 mg的GST-PspA融合蛋白,而方法4复性效率最高,最终获得2.2 mg的高纯度GST-PspA融合蛋白。

图4 不同复性方法下重组PspA蛋白纯化情况

3 讨 论

细胞质膜保护细胞免受环境胁迫的影响,并赋予细胞结构的完整性。胞质外不同应激条件会破坏质膜平衡，从而导致跨膜电位的损失和PMF的耗散,而Psp系统则通过保护质膜的完整性来维持质子梯度和保护PMF。Psp系统的核心成分是外围质膜结合蛋白PspA,负责Psp反应的负向调节和效应功能[14],可与内膜结合形成高阶寡聚体效应复合物,修复质膜损伤并保护PMF[15]。

本研究通过克隆丙二酸盐克罗诺杆菌pspA基因全长序列,并成功诱导纯化该基因编码的PspA蛋白。实验结果显示,因大肠杆菌表达菌株BL21表达效率高,融合蛋白合成速度过快,蛋白间非特异性结合过多,未及时在细胞内进行折叠而聚集形成PspA包涵体蛋白[16]。本实验将所获得的PspA包涵体蛋白溶解于高浓度的尿素缓冲液中,通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键使之变性,增加蛋白的可溶性。继而缓慢去除变性剂,使目标蛋白从完全伸展状态恢复到正常的折叠结构。本研究中方法1和方法2为稀释复性法,向包涵体蛋白中直接加入不同配方的缓冲液,改进放置条件,经SDS-PAGE检测发现复性效率较低,其原因可能是蛋白溶液体积增加较大,变性剂稀释速度过快,导致可溶性蛋白的重折叠不易控制。方法3和方法4为透析法,透析袋中的蛋白样品与外透液进行离子交换直到除去大部分小分子物质。方法4通过逐步降低透析缓冲液中的尿素浓度来去除蛋白样品中的变性剂,并且在复性缓冲液体系中引入甘油增加溶液的黏度,减小分子碰撞形成聚合体的可能,添加还原性/氧化性谷胱甘肽来促进重组PspA蛋白形成正确的二硫键,而精氨酸则能够避免复性中重组PspA蛋白相互聚集,具有稳定蛋白质的作用[17]。通过SDS-PAGE检测分析PspA蛋白的复性纯化效率,结果显示复性方法4能够在一定程度上恢复重组蛋白的生物学活性,且效率最高。

克罗诺杆菌对所有年龄段人群都具有致病性,且危害大、致死率高[18]。克罗诺杆菌作为婴幼儿配方奶粉的A类致病菌[19],近年来引发多起食品安全事件而备受世界卫生组织、国家政府以及消费人群的高度关注。因此,本研究成功诱导了丙二酸盐克罗诺杆菌PspA蛋白,为后续从基因及蛋白水平方面探究该菌能够长期存活在干燥环境中的分子调控机制及蛋白互作网络提供理论基础,同时也对减少和避免易染食品的污染和污染后的防治具有重要意义。