“肾主骨”理论 “髓变先于骨变”的肾-髓-骨调节机制构建

王璠琛 何琪 肖嘉聪 潘兆丰 黎淼 黎少聪 王海彬

1．广州中医药大学,广东 广州 510405

2．广州中医药大学第一附属医院,广东 广州 510405

中医“肾主骨”理论起源于距今2000多年前的《黄帝内经》,其解释了肾、髓、骨三者生理病理变化的互相作用。《素问·痿论》载:“肾气热,则腰脊不举,骨枯而髓减,发为骨痿。”从生理上来讲,肾为先天之本,肾藏精,精生髓,髓养骨。从病理上来看,“肾病及骨”“髓虚则骨失所养”,现代医学角度揭示了其原因是骨髓内细胞如破骨细胞等及其分泌因子代谢异常,造成内环境紊乱引起骨的异常症状。在临床最为典型的就是慢性肾脏病-矿物质和骨异常(chronic kidney disease-mineral bone disorders,CKD-MBD)、骨质疏松症(osteoporosis,OP)等。

随着临床骨病与科研成果的深入研究,本研究团队已逐步洞悉了疾病发展的动态过程,创新性地提出“髓变先于骨变”的论点,沿循中西医基础理论相结合的路线,尝试构建肾-髓-骨整体调节机制。本文将从5个方面分析其功能相关及分子基础,并阐释中医“肾主骨”理论指导下“髓变先于骨变”的肾-髓-骨整体调节机制的临床意义:①中医学与现代医学对肾、髓、骨的认识;②“髓变先于骨变”的理论依据;③“髓变先于骨变”在临床疾病发展中的动态表现;④生理状态下肾-髓-骨调节机制;⑤病理状态下肾-髓-骨调节机制。

1 中医学与现代医学对肾、髓、骨的认识

在古代医家的认知中,肾为五脏之一,肾主藏精、主水、主纳气,是人生长发育的重要器官;髓为奇恒之腑,包括脑髓、脊髓和骨髓,其中骨髓具有养骨、生血之功效;骨藏髓,主司支持与运动[1]。三者组成了人体发育、运动的基本结构。

随着现代医学的不断研究,越来越多的理论表明中医学的“肾”中还存在“功能肾”这一功能单位。功能肾在多个层面影响着骨、髓及其分子水平的物质代谢[2];同时在现代医学中,骨不仅作为一种支撑人体的组织,还是一种与肾、髓互相影响的内分泌器官[3];对髓的现代医学认识包括骨髓内各种细胞及细胞因子,如骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)、各种骨细胞及其分泌的因子等,这些研究拓展了肾、髓、骨的生理功能。同时有研究认为,受精卵作为全能干细胞其具有生长发育、繁衍生育的功用[4],这一点与肾精中的先天之精相似,其“生髓”分化成为BMSCs等,BMSCs等在特定条件下向成骨转化,实现“养骨”,这与中医理论“肾精生髓养骨”高度吻合。

2 “髓变先于骨变”的理论依据

在现代医学研究中,对于髓内物质种类的认识越发广泛,常见的与骨病相关的髓内物质包括:骨髓间充质干细胞、脂肪细胞、成骨细胞、破骨细胞、及其所分泌的物质等。髓内细胞及其分泌物直接影响着骨的形态与质量,调控骨代谢过程。骨病的形成是髓内相关物质代谢异常而出现的症状,被认为符合“髓变先于骨变”的过程。

2.1 骨髓间充质干细胞

BMSCs是骨髓中能够自我更新、分化为有限数量的细胞类型、支持造血细胞、调节免疫活性的祖细胞群体,随着人年龄的增长,BMSCs的增殖和分化水平显著降低[5]。在老年性骨质疏松症中,核小体组装蛋白1样2(nucleosome assembly protein 1-like 2,NAP1L2)的表达在衰老过程中显著升高,与BMSCs的成骨能力受到抑制密切相关[6]。相关研究揭示了NAP1L2激活核因子-Kappa B(nuclear factor- kappa B,NF-κB)途径并通过表观遗传调节组蛋白H3K14乙酰化多克隆抗体的组蛋白乙酰化,削弱成骨的可能调节机制[7]。NAP1L2通过NF-κB信号通路调节细胞衰老过程,确定NAP1L2是BMSCs衰老的重要调节剂。在骨质疏松症发展过程中,BMSCs分化为成骨细胞的能力降低,从而导致骨形成减少,证明BMSCs分化改变导致骨质疏松症的形成[8]。

有相关研究表明,BMSCs分泌外泌体长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录子1通过介导microRNA-34c/SATB2轴缓解骨质疏松症;另外,抑制线粒体吞噬可以促进BMSCs衰老,重要的线粒体代谢调节酶Sirtuin-3 (Sirt3)可以通过激活线粒体吞噬作用来延缓BMSCs衰老并表现出良好的抗骨质疏松作用[9-10]。

2.2 骨髓脂肪组织及骨髓成脂谱系前体

骨髓主要分为红骨髓和黄骨髓两种类型,其中红骨髓是由造血细胞组成,黄骨髓主要由脂肪细胞组成,骨髓脂肪组织(bone marrow adipose tissue,BMAT)占全身脂肪的10%以上[11]。长期以来,BMAT被认为是一种惰性填充物,占据了骨丢失和造血减少造成的空隙,而现在,BMAT被认为是一种分泌和代谢器官,并分泌间接影响骨代谢的细胞因子[12],骨髓脂肪细胞不仅作为储存组织,而且还是内分泌和旁分泌细胞,具有促进局部和全身代谢的潜力。骨髓中脂肪细胞的数量在骨骼生长过程中逐渐增加,但在衰老过程中也逐渐增加[13]。这一过程与骨中的代谢过程平行。在脂肪组织分泌因子中,最重要的是脂联素和瘦素。BMAT分泌的脂联素以抗成骨方式发挥作用,通过骨微环境中的旁分泌机制在短期内阻断成骨细胞增殖[14]。同时,瘦素增强T淋巴细胞反应,通过炎症反应导致破骨细胞活性增加,因此对骨代谢产生影响[15]。

单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)的出现为研究组织中的细胞异质性提供了机会。骨髓间充质基质细胞是含有间充质干细胞以及其它细胞类型的高度异质性细胞群,近期一些研究确定了间充质基质细胞的一个突出亚群-骨髓成脂谱系前体(marrow adipogenic lineage precursor,MALP),其不含脂滴,且特异性表达脂肪细胞标志物。并认为它是骨髓脂肪组织的主要细胞成分[16]。有研究表明,MALP具有细胞体和多个突起,形成3 D网络结构,几乎接触骨内的每个细胞,认为MALP的主要功能是调节骨髓环境,包括骨吸收,研究确定MALP在正常骨代谢和病理性骨丢失过程中,在以NF-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)依赖性的方式控制骨重建中起到了关键作用[17]。

2.3 骨髓来源的巨噬细胞

居住在骨中的巨噬细胞 (bone marrow-derived macrophages,BMMs) 可以通过分泌细胞因子和外泌体来调节骨代谢,在维持骨稳态方面起到重要作用[18],常与血管形成相结合,血管内皮细胞 (endothelial cell,EC) 分泌外泌体(endothelial cell-secreted exosomes,EC-Exos),可以被BMMs内化,在体外抑制破骨细胞活性。如:microRNA-155(miR-155)是特异性miRNA前体,破坏BMMs的分化和激活,抑制破骨细胞的分化[19]。BMMs内化大量EC-Exos,EC-Exos通过向BMMs递送miR-155来抑制破骨细胞骨吸收[20]。

2.4 成骨细胞和破骨细胞

成骨细胞(osteoblast,OB)由BMSCs分化而来,负责骨基质的合成、分泌和矿化[21]。其分化和增殖是通过Runx2转录因子[22]、骨保护素 (osteoprotegerin,OPG)/RANKL通路和经典的Wnt信号通路等传导途径发挥重要作用。OB产生羟基磷灰石-骨矿物质,形成致密的矿化组织-矿化基质,是维持生理稳态的重要矿物质。OB通过释放RANKL等分泌物参与破骨细胞(osteoclast,OC)的调节[23]:RANKL与在OC前体上表达的NF-κB的受体激活剂(receptor activator of nuclear factor kB,RANK)之间产生相互作用,诱导OC前体分化为OC。同时,OB还可以通过产生OPG来调节OC的形成,OPG通过与RANKL竞争性结合RANK抑制OC生成[24]。OC由多核巨噬细胞组成,负责骨的吸收。其形成和功能均受巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和RANKL的调节[25]。OC释放组织蛋白酶K,切割处理胶原蛋白基质,溶解、吸收骨基质以及骨矿物质,将矿物质降解以钙离子的形式排到血液中[26]。

OB与OC有助于维持和修复骨量,两者形成动态平衡稳态,当一者功能异常,临床出现生长发育障碍、骨骼畸形、骨折不愈合、骨质疏松等。在骨骼成长及代谢更新过程中,OB和OC作用相反、相辅相成[27]。

2.5 “髓变先于骨变”中肾脏的作用

同样,髓与骨的变化也反作用于肾脏,如:Klotho-成纤维细胞生长因子23(fibroblast growth factor,FGF23)系统在慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)中矿物质和骨代谢的改变中起着至关重要的作用[28]。细胞分泌的骨钙素与CKD、糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease,DKD)的发病密切相关,骨硬化蛋白由骨细胞分泌产生并发挥作用。以上作为细胞产生的分泌物,被认为是髓的一部分,既导致了骨质的改变,又作用于肾脏的代谢,参与肾性骨营养不良的过程。

2.5.1机体磷酸盐稳态与FGF23因子:大多数循环FGF23来自骨细胞和OB。在Klotho-FGF23系统中,肾脏上分布了大部分的Klotho蛋白和FGF23受体,因此肾脏是Klotho-FGF23系统中发挥FGF23作用的主要靶器官[29]。研究表明,FGF23的循环随着肾功能的下降而急剧上升,并且在CKD患者异常矿物质代谢的发展中起关键的起始作用[30]。轻度CKD中,FGF23似乎起着保护因子的作用,因为它触发了适应性变化维持正常磷酸盐血症。机体的磷酸盐稳态是一个复杂的激素过程,涉及多个器官,包括肠、肾、骨和甲状旁腺等[31]。FGF23可通过增加尿磷酸盐排泄调控肾脏的代谢功能[32]。

2.5.2骨钙素:骨钙素(osteocalcin)是一种由成熟OB表达的特异性分泌蛋白[33]。骨钙素的升高是CKD患者骨量减少、出现骨质病变的最敏感标志。同时,骨钙素的血浆水平与胰岛素敏感性呈正相关,较低的骨钙素水平与糖尿病和DKD的发病风险增加相关[34]。然而迄今,从一些小样本横断面研究中得出的关于骨钙素和DKD关联的一些结论仍然存在争议[35]。

2.5.3骨硬化蛋白:骨硬化蛋白(sclerostin)是一种由骨细胞产生的旁分泌糖蛋白,主要由成熟的骨细胞表达,是Wnt信号传导的骨形成的负调节剂,以及骨表面OB和OC的活性调节剂[36]。硬化蛋白通过占据Wnt共感受器LRP5/6和阻止其与Wnt配体的结合来拮抗Wnt信号传导,从而抑制下游经典Wnt信号传导,抑制成骨分化和OB活性,高水平的表达可以显著抑制CKD-MBD患者的骨生成[37]。此外研究表明硬化蛋白可以通过对近端小管细胞的直接作用和通过FGF23间接调节活化的维生素D[1,25(OH)2D3]的合成,调节能量平衡和肾脏中的矿物质代谢[38]。

3 “髓变先于骨变”在临床疾病发展中的动态表现

“功能肾”是下丘脑-垂体-多个靶腺系统的体现,分泌性激素等及其他物质,与髓、骨关系密切,而现代研究表明“肾虚证”是一种“功能肾”系统紊乱影响代谢、全身生理功能减退的一种机体反应状态[39]。BMSCs来自于髓,在特定情况下向OB转化率降低导致骨质疏松症(osteoporosis,OP)的形成[40],除此如非创伤性股骨头坏死(nontraumatic osteonecrosis of the femoral head,NONFH)[41]、骨关节炎(osteoarthritis,OA)[42]等骨科疾病也与“髓变”有着密不可分的联系(图1)。

3.1 骨质疏松症

骨质疏松症是常见骨病,分为原发性和继发性。原发性骨质疏松症是随着年龄增长发生的一种生理退行性病变,又可分为绝经后骨质疏松症(I型)和老年性骨质疏松症(Ⅱ型),分别是由于雌激素减少导致骨吸收大于骨形成及人体衰老后单位体积骨量低于正常值造成的[43]。继发性骨质疏松症是除了与年龄相关、性腺功能减退的骨丢失外,人体自身循环代谢异常引起的骨质疏松[44]。其机制包括慢性炎症导致高水平的OC刺激细胞因子、体重减轻伴合成代谢激素量减少等。糖皮质激素主要通过OB和骨细胞凋亡导致骨形成减少而引起骨丢失[45]。其与“功能肾”系统分泌的性激素等物质密切相关。这些因素在长时间内都是被学者们一直所研究的。

新的研究表明,年龄相关的DNA损伤,会减少骨细胞的产生[46]。BMSCs在老化过程中相关DNA损伤,使得它们更有可能转化为脂肪细胞而不是OB,也会导致BMSCs表达p53蛋白,这种蛋白质可以阻止其分化成为OB。

3.2 骨关节炎

骨关节炎属中医学“痹症”范畴。其关节退化的发病机理还不完全清楚,但是导致合成代谢和分解代谢之间不平衡的低度炎症是一个公认因素。BMSCs可以定向分化为软骨细胞并可调控软骨细胞的代谢。软骨细胞对微环境的反应来维持细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成和降解之间的平衡。基质降解酶的表达增加、基质合成抑制和促炎介质的过量产生,造成ECM成分丢失,在耗尽区域中扩张的软骨细胞聚集,细胞环境中诱导氧化,发生软骨细胞凋亡[47];软骨细胞退变,炎症细胞因子上调T淋巴细胞发生免疫反应,阻碍骨吸收,加重软骨退化[48]。另外“痹症”还包括类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA),有研究显示其是由于“功能肾”下丘脑-垂体-肾上腺轴失调导致,“髓变”引起了机体免疫力、应激反应等变化,最终造成炎症反应及自身免疫疾病[49]。

3.3 非创伤性股骨头坏死

中医“髓”与BMSCs及组织微环境高度相似,而非创伤性股骨头坏死(nontraumatic osteonecrosis of the femoral head,NONFH)发病机制与“髓”状态改变密不可分,如脂质代谢紊乱、凝血机制紊乱、骨内压增高等状态[41]。长期大剂量使用类固醇激素,引起脂肪代谢紊乱,抑制BMSCs的成骨分化,促进更多的向脂肪细胞转化。此外,激素可诱导细胞凋亡,延长OC的存活期,造成股骨头的塌陷坏死[50]。同时研究发现,还可由miR-132-3p和miR-335等外泌体通过Wnt、Foxo和Rap1信号通路诱导内皮细胞凋亡,在激素诱导的ONFH中发挥重要作用[51]。

综上临床与科研上的长期深究,印证了“髓变”与“骨变”是存在顺序的动态改变,“髓变先于骨变”,并且其过程与“功能肾”的病变息息相关。

4 生理状态下肾-髓-骨调节机制

肾脏与髓、骨的关系高度复杂且密切。正常生理状态下肾对二者的指导调控作用体现在电解质离子、蛋白质分子的稳态调控。肾脏是参与调节钙、磷酸盐稳态的主要器官,肾脏合成的许多物质,例如1,25(OH)2D3、骨形态发生蛋白7和促红细胞生成素,都参与了骨形成、重塑和修复的不同阶段。一些可受肾脏影响的细胞因子也为髓、骨的正常生理活动提供物质基础[52]。同时,肾脏的重吸收作用,供给髓内细胞的分化调控功能,吸收必要元素供给骨正常生理活动。

4.1 钙、磷酸盐稳态

肾脏通过调节钙和磷酸盐的稳态来影响骨骼的结构和功能。肾脏过滤的钙和磷酸盐在肾小管不同部位被重吸收[53]。钙直接刺激OB的形成,同时抑制OC通过钙敏感受体形成[54]。磷酸盐可以通过NF-κB (RANK)-(RANKL) 信号传导和OPG的受体激活剂,直接促进OC凋亡并抑制其分化[55]。

在循环中,钙和磷酸盐的吸收与重吸收,主要是受1,25(OH)2D3通过增加其转运蛋白在肾小管细胞中的表达来发挥作用[56]。1,25(OH)2D3是维生素D的一种激活形式,通过结合肠、肾和骨中的维生素D受体来调节钙和磷酸盐的稳态以及骨骼的发育和修复[57]。在OB中,1,25(OH)2D3影响胶原蛋白I的合成以及碱性磷酸酶等表达,刺激骨基质矿化,促进骨盐沉积、骨形成钙化[58]。在OC中,起到双向作用:一方面,它通过增加软骨细胞和OC上RANKL的表达来刺激OC生成[59];另一方面,在OC前体中,1,25(OH)2D3通过下调集落刺激因子-1受体直接抑制RANK的表达[60]。

4.2 骨形态发生蛋白7和促红细胞生成素

骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein 7,BMP-7)主要合成部位是肾脏,参与骨的形成与生长过程,对骨骼的生长发育起到一定的促进作用。BMP-7的表达可以促进骨质的改善和骨折的愈合[61]。BMP-7在肾脏内产生后,不断被释放到体内循环系统,参与人体内循环,以激素样方式在远端发挥作用[62]。

而人体大部分全身性促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是由肾小管周围间质成纤维细胞在肾皮质和肾外髓质中的肾促红细胞生成细胞产生的[63]。EPO可以通过JAK2/Stat3信号通路增加造血干细胞的BMP2表达,诱导体外OB从BMSCs分化和体内骨形成[64]。其在骨形成、骨折愈合之中起着重要的促进作用。

5 病理状态下肾-髓-骨调节机制

肾、髓、骨三者形成整体调节机制,一者出现功能障碍则整体代谢过程改变,导致机体出现异常表现。CKD是一种复杂的多因素疾病,在慢性肾脏病的过程中,CKD-MBD伴生化和激素的改变是其病程进展相关并发症的一部分,同时随着糖尿病的患病率不断提升,DKD也逐渐成为CKD的主要病因之一,DKD合并骨质疏松症更是现代医学研究的重点。

慢性肾脏病-矿物质和骨异常(CKD-MBD)包括:钙、磷、甲状旁腺素(PTH)或维生素D的异常; 骨转换、骨矿化、体积、线性生长或强度的异常;血管或其他软组织钙化[65]。肾脏疾病是骨质下降的重要因素,骨质疏松症、骨折等疾病的风险与肾脏功能下降之间也存在着正比关系[66]。CKD-MBD导致骨质疏松症的形成,控制钙和磷酸盐代谢的经典激素在3～4级CKD期间变得异常: PTH增加,1,25-二羟基胆钙化醇减少。其他激素在早期阶段变得异常,包括FGF23以及主要来自肾脏的Klotho。它们相互关联并且涉及OB发育所必需的Wnt信号通路[67]。

目前的多数研究将DKD合并骨质疏松症归于CKD-MBD的范畴[68],但是与其他CKD导致的骨质疏松不同的是,在糖尿病患者中,肾脏未出现损害时,胰岛素的缺乏、饮食的限制及体内分泌物质等的变化也可以导致骨质疏松的发生[69]。

上述疾病在肾脏发生病变后,肾脏代谢和重吸收功能异常,髓内分泌物产生异常,导致骨质出现异常表现,符合“肾-髓-骨整体调节机制”理论范畴。

6 构建中医“肾主骨”理论指导下“髓变先于骨变”的肾-髓-骨整体调节机制的临床意义

“肾主骨生髓”是中医经典理论,也是与现代医学研究相吻合的正确理论。迄今为止,“髓变先于骨变”论点是王海彬教授团队在长期探究中首次提出的。在临床上,本团队收集各类骨病患者临床样本,运用“补肾填髓强骨法”遣方用药,探究髓变与骨变的内在联系;在科研上,本团队利用先进技术,围绕骨髓微环境、骨髓间充质干细胞、成骨破骨细胞进行持续研究,由此发现BMSCs介导的骨脂代谢失衡在骨质疏松症发病的过程中具有关键作用,如何寻求调控骨脂平衡的新切入点已经成为抗骨质疏松症亟待解决的问题。因此,本研究团队突破性地提出“髓变先于骨变”这一论点,为治疗骨病提供一种崭新的思路-“治骨先治髓、髓充骨自强”。该论点的提出将有助于揭开更多组织、器官、系统之间的潜在联系,为进一步研究肾、髓、骨整体指明研究方向。该理论体系的构建发挥了中医学临床特点,对骨病进行中医系统化诊察;同时包融现代医学,在“肾主骨”的中医理论指导下,利用分子生物学论证“髓变先于骨变”的肾-髓-骨整体调节机制,为中医学的现代化发展做出表率。