壮骨止痛方通过RANKL/RANK信号通路抑制骨吸收的机制研究

蔡昕瑶 陈瑶 陈诗淇 郁洁 雷晓明

1. 湖南中医药大学中西医结合学院,湖南 长沙 410208

2. 湖南中医药大学针灸推拿与康复学院,湖南 长沙 410208

3. 湖南中医药大学医学院血管生物学与转化医学湖南省重点实验室,湖南 长沙 410208

骨质疏松症(osteoporosis, OP)是一种骨代谢障碍的慢性疾病,以骨量流失,骨组织内部结构被打乱,骨单位遭到破坏,骨脆性增加甚至并发骨折为主要特征[1]。女性绝经后雌激素水平下降,成骨细胞(osteoblast,OB)介导的骨形成活动和破骨细胞 (osteoclast, OC)介导的骨吸收活动平衡被打破,出现腰背疼痛,骨量下降,骨质流失等骨质疏松症的表现[2]。各种酶、炎症、内分泌以及机械刺激信号调控着破骨细胞活动,促使溶骨作用增强,骨吸收活动呈现高活跃状态[3]。研究表明绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)的发病与骨重建活动中骨转换率升高密切相关,而核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL)-核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB,RANK)调控破骨因子使其在溶骨效应中发挥重要作用[4]。成骨细胞所表达的RANKL与其受体RANK相结合,诱导破骨细胞的成熟分化[5]。RANKL/RANK信号失调将导致破骨活动增强,影响骨代谢[5]。因此阻断RANKL/RANK信号通路抑制破骨因子过度活跃,改善骨耦联代谢失衡是防治PMOP的重要举措。

中医认为PMOP病机主要为肾虚,壮骨止痛方由7味补肾中药构成,课题组前期实验研究及医院治疗中的使用过程证实壮骨止痛方具有促进成骨分化、促进骨形成、增加骨密度的疗效,对于防治PMOP具有显著作用[6]。但壮骨止痛方通过调控破骨细胞活动发挥抗PMOP的具体机制尚不明确,因此本研究的目的是研究壮骨止痛方对去势大鼠骨组织破骨因子血清水平和蛋白表达的影响,进一步探索壮骨止痛方调控CTSK、RANK、TRAP等破骨因子干预PMOP的部分具体疗效机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1动物:SPF级3月龄体质量220～280 g雌性SD大鼠40只,授权于湖南中医药大学动物实验中心向湖南斯莱克景达实验动物有限公司购买,放置在湖南中医药大学清洁级动物实验中心饲养,饲养中心许可证号:SCXK(湘)2019-0009,动物批号:SCXK(湘)2019-0004,采用普通饲料喂养,饲料由动物中心统一购置,环境温度18～24 ℃,湿度40 %～60 %,模拟12 h昼/夜循环照明,分笼饲养。保持笼舍洁净,及时换新洁净垫料,大鼠可以在笼舍内自由活动、摄取食物、饮水。本研究所有动物实验设计和操作流程符合动物伦理的要求,获动物实验伦理委员会批准,伦理编号:LL202205250。

1.1.2主要仪器:珀金埃尔默股份有限公司Quantum GX型小动物显微CT(美国);Rayto,RT-6100型多功能酶标仪;卢湘仪离心机仪器有限公司TGL16M台式高速冷冻离心机(中国 上海);赛默飞世尔科技有限公司HM325型石蜡切片机;麦克奥迪电气股份有限公司BA410E 型显微镜。

1.1.3主要药品及试剂:壮骨止痛方由枸杞子、淫羊藿、骨碎补、女贞子、怀牛膝、补骨脂、狗脊7味中药构成,上述所有中药在湖南中医药大学第一附属医院中药房购买;拜耳医药保健有限公司规格为1 mg/片 戊酸雌二醇,批号:J20171038;戊巴比妥钠,批号:20200422产自美国默克公司;青霉素钠,批号:F9102109由华北制药股份有限公司生产;RANKL ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司,批号:20221101-30267A)E2ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司,批号:202201101-30432A)。EDTA慢速脱钙液 (Servicebio);兔抗大鼠抗体RANK (Immunoway YT5881);兔抗大鼠抗体TRAP (爱博泰克A0962);兔抗大鼠抗体CTSK(爱博泰克A5871);电镜固定液(武汉赛维尔生物科技有限公司,批号:G1102)。

1.2 方法

1.2.1动物分组及模型建立:40只SD大鼠按照完全随机原则,分为ZGZTF组、EV组、OVX组、SHAM组,每组10只。各组均采用国内外常用造模方法建立绝经后骨质疏松症病理模型[7],SHAM组摘除同等体积脂肪。现配2 %戊巴比妥钠溶液,按照0.4 mL/100 g对大鼠进行腹腔注射。将麻醉好的大鼠固定于鼠板,摘除双侧卵巢后进行缝合,碘伏消毒伤口防治大鼠互相撕咬,造模后3 d为防术后感染从大鼠后腿注射4万U青霉素。

1.2.2药品制备:将所有中药放入煎药灌中浸泡1 h,武火煮沸后改文火继续煎煮1 h,将煎煮所得药液倒出,加入与第一次煎煮同等体积蒸馏水继续煎煮1 h,将两次所得药液搅拌混合,所得混合液按照生药含量6.6 g/kg 浓缩,待中药药液冷却后放入冰箱冷藏。

1.2.3给药方法:手术1周后给予药物灌胃,1次/d,连续给药12周。ZGZTF组灌胃6.6 g/kg生药量的中药药液,EV组灌胃剂量体表面积换算公式按照绝经后女性体重水平来确定(成人剂量×60 kg×0.018/0.2 kg),余下各组灌胃相应体积的蒸馏水。

1.2.4Mirco-CT检测股骨骨微结构和骨密度:每组随机选取3个样本,剔除右侧股骨表面多余结缔组织后应用显微CT从生长版最高点以下1 mm位置往下数50层的骨小梁进行平扫。扫描模式为:扫描电压90 kV,扫描电流为88 μA,360 °旋转扫描,扫描持续14 min,分辨模式为90 u,扫描结果采用Analyze12.0分析。

1.2.5HE检测骨组织病理形态:取左侧胫骨,置于4 %多聚甲醛中浸泡1周,在EDTA脱钙液中浸泡2个月,每4～6天更换脱钙液。经脱水、包埋、切片、封片、染色后用显微镜观察骨小梁结构。

1.2.6扫描电镜检测骨组织骨小梁超微结构:将大鼠左侧胫骨的肌肉组织剔除,保留完整胫骨组织和骨膜,用浓度为 0.1 %的磷酸缓冲液对胫骨进行清洗,采用2.5 %戊二醛溶液固定,随后用叔丁醇梯度脱水,置于-10 ℃冰冻,干燥。导电胶固定标本后将金属材料喷涂于骨组织表面,使用扫描电子显微镜观察孔隙内骨组织及纤维组织生长情况。

1.2.7ELISA检测血清E2、RANKL水平:终末取材时,按照0.4 mL/100 g的剂量给各组大鼠注射2 %戊巴比妥钠麻醉,注射方式为腹腔注射,腹主动脉采血,静置2 h,3 000 r/min离心15 min后分离血清,采用双抗夹心技术对大鼠血清中E2、RANKL水平进行测定,用酶标仪测定各组在450 nm波长时的吸光值,对数据进行统计学分析。

1.2.8免疫组化检测RANK、TRAP、CTSK蛋白表达:取左侧胫骨,置于4 %多聚甲醛中浸泡1周,在EDTA脱钙液中浸泡2个月,每4～6天更换脱钙液。经过脱水、透明、切片后,滴加一抗进行孵育,室温过夜。PBS清洗3次,滴加二抗,室温中静置1 h,显色后终止反应,显微镜下观察切片视野,采用Image Pro Plus 6.0 图像分析处理软件对RANK、TRAP、CTSK蛋白的IOD进行比较分析。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 壮骨止痛方对大鼠骨微结构和骨密度的影响

与SHAM组相比,OVX组股骨骨密度值显著下降,骨质流失严重,差异具有显著性,差异有统计学意义(P<0.05)。与OVX组相比,给药后ZGZTF组股骨骨密度增加,但差异无统计学意义。

表1 各组大鼠骨组织骨密度差异

注:与SHAM组相比,#P<0.05。

2.2 壮骨止痛方对大鼠骨组织病理形态改变的影响

显微镜下,SHAM组胫骨骨小梁排列整齐,连续性好,镜下可见大量骨细胞。与SHAM组比较,箭头所指处可明显看到OVX组胫骨骨小梁结构紊乱,连续性中断,骨髓腔变宽,骨小梁间隔变大,结构严重缺失,镜下可见骨髓腔内有大量脂肪空泡。与OVX组相比,ZGZTF组胫骨骨组织形态有不同程度的改善,骨小梁增多,连续性稍恢复,骨髓腔减小,脂肪空泡减少。

2.3 壮骨止痛方对大鼠骨小梁超微结构的影响

SHAM组大鼠胫骨骨小梁数目较多,骨小梁表面胶原纤维排列紧密,骨小梁壁厚且均匀,形态大小对称,连接性好,形成立体的网状结构。OVX组大鼠胫骨骨小梁网状结构遭到破坏,骨小梁数目减少,间距增大,骨小梁变细且厚薄不均。小梁表面骨胶原纤维排列紊乱,粗细不均。与OVX组相比,ZGZTF组胫骨骨小梁数目增多,立体网状结构有所改善,但与SHAM组比较骨小梁数目仍然较少,间距仍然较大。

图3 各组大鼠骨组织骨小梁病理形态学检测结果(100×)

图4 各组大鼠骨组织电镜扫描图(100×)

2.4 壮骨止痛方对大鼠血清E2、RANKL水平的影响

与SHAM组相比,OVX组血清中E2显著下降,RANKL水平显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与OVX相比,ZGZTF组血清中E2水平升高,RANKL水平降低(P<0.05)。ZGZTF组血清E2和RANKL表达水平与SHAM组相比差异无统计学意义(P>0.05)。ZGZTF组和EV组血清中E2、RANKL水平差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 壮骨止痛方对去势大鼠血清E2、RANKL影响的比较

注:与SHAM组比较,#P<0.01;与OVX组比较,&P<0.01。

2.5 壮骨止痛方对大鼠胫骨RANK、TRAP、CTSK蛋白表达的影响

与SHAM组比较,OVX组胫骨骨组织中RANK、TRAP、CTSK蛋白表达显著上升,表达较高,差异具有统计学意义(P<0.05);与OVX组相比,ZGZTF组胫骨骨组织中RANK、TRAP、CTSK蛋白表达明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05);ZGZTF组和EV组阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)。见图6、图7。

注:与SHAM组比较,#P<0.05;与OVX组比较,&P<0.05。

3 讨论

中国作为人口老龄化大国,OP的高发病率和高骨折率对社会造成了严重的负担,导致了沉重的经济负担[8]。研究表明我国OP的总患病率为6.6 %～19.3 %[9],第七次全国人口普查数据显示我国50岁以上人群骨质疏松症患病率为19.2 %,其中女性为 32.1 %[10]。中医学无OP病名,根据临床表现认为其属于“骨痿、骨痹”范畴,肾主骨生髓,在骨生长发育中起重要作用[11],传统中医学理论认为OP主要发病病机是肾精不足骨髓失于濡养[12]。

壮骨止痛方是莫新民教授创制的经验方,于2005年获得国家新药证书,该方由7味补肝益肾中药构成,方中补骨脂归肾脾两经,有温肾阳补脾阳之功效,是为君药。臣以淫羊藿益筋骨补命门,使筋骨自坚时亦可助君药补肾[13]。补骨脂和淫羊藿配伍归入肝经、肾经,发挥壮骨补肾强腰膝的作用,治疗肾阳不足肝肾亏损[14]。牛膝和骨碎补逐瘀通经、通经活络,使补中寓通,补而不滞,枸杞女贞补肝肾阴精,阴中求阳,诸药配伍阴阳肝肾并补,治疗PMOP[15]。补骨脂发挥雌激素样作用逆转骨组织Leptin启动子高甲基化,从而抑制破骨基因的表达[16]。淫羊藿的主要化学成分之一是黄酮类化合物,在治疗PMOP中它可以发挥抑制破骨细胞活动,促进成骨细胞增殖分化的作用[17]。研究表明骨碎补可能通过作用于氧分压感传信号通路上关键靶点HIF1ɑ抑制破骨细胞活动[18]。李晓曦等[19]研究发现女贞子与淫羊藿的配伍组合可以上调TGF-β1/Smad信号通路骨保护性相关蛋白起到抗OP的作用。

本研究中采用手术去卵巢方法构建PMOP的病理模型,骨质流失和骨小梁结构的改变均证实PMOP病理模型构建成功[20]。给予壮骨止痛方干预之后,去势大鼠骨微结构改善,表明壮骨止痛方可以抑制破骨细胞关键因子从而调控骨代谢。

破骨细胞主要受到细胞因子RANKL的调节,RANKL对于维持骨稳态具有关键作用,在骨质疏松病理性骨吸收中发挥核心作用[21]。调控破骨细胞的分化和功能一直是防治PMOP的热门话题。RANKL和RANK结合后募集TRAF-6激活下游MAPK和NF-κB信号通路,活化NFATc1,NFATc1等转录因子发挥协同作用实现破骨基因表达[22]。而MAPK信号通路通过调节下游转录因子调控组织蛋白酶K吸收骨基质降解骨,促进骨吸收[23]。MAPK信号通路上调后可激活NF-κB信号通路影响骨吸收,此外细胞因子及诱导物刺激NF-κB后可以调节氧化应激反应及炎症介质的表达,从而调控骨吸收活动[24]。另外RANKL和RANK结合还会影响细胞内Ca2+波动诱导破骨细胞分泌CTSK和基质金属蛋白酶及TRAP等破骨特异性因子[25]。

CTSK是破骨细胞中溶骨性最强的关键酶,其变异或过表达是会增加PMOP的发病率及骨折的发生风险[26],因此抑制CTSK的表达在一定程度上可以起到骨保护的作用。TRAP是酸性磷酸酶同功酶中的第5型,作为特异性标志酶,在一定程度上可以检验破骨细胞分化成熟与否,可以调节破骨细胞对骨基质的吸收[24]。TRAP可以通过水解破骨细胞的磷酸醋酶起到破坏细胞基质的作用[27],TRAP的表达异常会影响骨重建平衡。研究表明淫羊藿可以抑制CTSK降解骨质的活性[28],而补骨脂可以竞争性结合CTSK的活性位点降低CTSK于胶原端肽区相互作用[29]。补骨脂亦可发挥雌激素样作用,抑制TRAP降解骨基质固体钙磷化合物,抑制骨陷窝形成从而降低破骨细胞溶骨活性[30]。

本研究探明壮骨止痛方对破骨细胞活动影响的部分机制,RANKL/RANK信号通路在破骨细胞及骨吸收活动中起激动作用,激活RANKL/RANK通路后,CTSK、TRAP作为下游重要因子可促进破骨细胞分化增殖。而壮骨止痛方可以抑制RANKL/RANK激活下游MAPK、NF-κB信号通路的作用,减少RANKL/RANK通路上破骨因子蛋白阳性表达,使骨重建失衡得到一定程度的恢复,起到治疗PMOP的作用。但本研究具有一定的局限性,仅进行了体内研究,壮骨止痛方调控PMOP破骨活动具体机制复杂,未来研究中将结合体外实验,深入验证壮骨止痛方的作用机制。