瘤内免疫治疗与肿瘤消融的研究进展

王尊宪 陈慧颖 窦鹏挥

免疫肿瘤学（IO）是肿瘤治疗的基石。目前检查点抑制剂（CI）是多种转移性实体瘤的一线治疗方式，其在辅助和新辅助治疗中的应用价值正逐步增大。然而，现有的全身免疫治疗存在局限性，疗效很大程度上取决于抗原特异性效应T 细胞介导的反应，而效应T 细胞必须克服物理和生化障碍以发挥其效应功能。致密的肿瘤基质、抑制性趋化因子、细胞因子谱以及多种免疫抑制细胞类型的存在形成免疫抑制肿瘤微环境（TME），而CI 单药治疗无法克服免疫抑制的TME。目前，研究者已经开展了将免疫抑制TME 转化为免疫原性TME 的新的治疗模式的研究。

人瘤内免疫治疗（HIT-IT）是一种很有前途的治疗策略，其在克服全身免疫治疗缺陷的同时直接解决免疫抑制TME[1，2]。HIT-IT 代表了一个广泛的治疗类别，尽管所有的治疗药物都是通过局部注射进入肿瘤[3]，但其作用机制各不相同。这种治疗方法的优点为：首先，HIT-IT 不受药代动力学的影响，局部注射药物的浓度比全身可耐受的浓度高许多倍，并且能够降低全身毒性，而局部注射也为一些无法进行全身治疗的患者提供新选择。其次，HITIT 可以诱导抗原呈递和免疫细胞启动，在免疫原性差的肿瘤中尤为重要。与CI 的机制不同，后者一般依赖于激活预先存在的抗原特异性效应细胞。再者，HIT-IT 可以规避TME 诱导的免疫细胞运输和迁移的错乱机制。此外，还可以设计出诱导免疫细胞募集到TME 的治疗方法。局部疗法的主要目标是在非注射肿瘤中诱导免疫介导效应，或所谓的无内源性（如体外）效应[1，3]。目前研究最充分的HIT-IT 只有FDA 批准的Talimogene laherparepvec（T-VEC），诱导注射的黑色素瘤病变快速消退，但对于非注射部位的疗效并不明显[4]，但因需要反复注射限制了其在常见肿瘤中的应用。

肿瘤消融是目前肿瘤治疗的新技术，并且有潜在的诱导抗肿瘤免疫反应。肿瘤消融技术的机制各不相同，但其治疗效果主要是通过破坏局部肿瘤来实现的。消融后的肿瘤组织留在原位，炎症介质、损伤相关分子模式（DAMPs）和其他免疫调节因子被释放[5]。大量的肿瘤抗原可供抗原提呈细胞处理[6]。虽然在某些类型的肿瘤如肝细胞癌[7]中消融能够诱导微弱的免疫作用，但单纯消融的免疫刺激作用通常不足以产生持久的抗肿瘤免疫反应。目前消融与IO[8]联合使用增强免疫治疗已进入了临床前研究阶段。随着肿瘤消融的免疫调节作用得到更好的定义和新型HIT-IT 的开发，联合治疗模式可能具有独特的协同潜力。

1 HIT-IT 联合肿瘤消融治疗策略

1.1 病毒介导的治疗策略一个多世纪以来，溶瘤病毒一直处于研究其直接溶瘤的潜力，但最近的研究集中于其诱导抗肿瘤免疫的能力。T-VEC 是一种转基因单纯性疱疹1 型病毒，是首个获得FDA 批准（2015 年）的溶瘤病毒，并应用于治疗晚期黑色素瘤。研究者提出了多种增强T-VEC 免疫效果的策略，包括联合应用CI，但Ⅱ期临床试验的结果并不理想[9]。已发表的临床前研究已经证实了溶瘤病毒和肿瘤消融的潜在协同作用。Sun 等[10]在胰腺癌小鼠模型中研究了Alphavirus M1 与不可逆电穿孔（IRE）联合使用，结果表明，该病毒增强了IRE 的治疗效果，并诱导了全身T 细胞免疫反应。主要机制是IRE 诱导的细胞膜孔隙度增强了病毒进入肿瘤细胞的能力，并且具有基质修饰效应，可使病毒能够更好地进入TME 内的肿瘤细胞。虽然这种特殊的溶瘤病毒在临床应用上存在局限性，但这项研究表明IRE 凭借其独特的作用机制，使TME 产生变化，增强肿瘤的病毒感染。

溶瘤病毒和肿瘤消融在治疗机制上是相悖的，因消融治疗的目的是摧毁肿瘤细胞，而溶瘤病毒需要宿主肿瘤细胞存活才能复制。Yamada 等[11]使用了新辅助治疗方法，首先用溶瘤性疱疹病毒G47delta 治疗肿瘤，然后再进行射频消融。他们在肝细胞癌小鼠模型中使用了该方法，结果表明联合治疗在原发性和继发性肿瘤中都产生了强大的CD8+T 细胞依赖性免疫反应。接受联合治疗的小鼠也能够抵抗肿瘤的复发，表明具有持久的肿瘤特异性免疫。

1.2 细胞介导的治疗策略过继细胞免疫疗法（ACT）在治疗血液系统恶性肿瘤方面已显示出卓越的临床疗效，在实体瘤中的应用也在进行中。评估转移性黑色素瘤的肿瘤浸润性淋巴细胞疗法（TILS）的多个Ⅲ～Ⅳ期的临床实验也在进行中，其他基于细胞的免疫疗法也在早期试验中。

局限过继细胞免疫疗法（ACT）治疗实体瘤是通过瘤内注射免疫细胞与肿瘤消融相结合。静脉注射免疫细胞必须运输并渗透到肿瘤组织中，才能发挥其效应因子功能，但这一过程往往被免疫原性差的肿瘤所抑制。肿瘤内递送的免疫细胞可以绕过致密肿瘤基质形成的物理屏障，不需要通过血液运输，并且克服TME[12]中的免疫抑制信号。瘤内注射免疫细胞与肿瘤消融相结合可以增强ACT 的瘤内浸润。在治疗细胞被输送前，分解肿瘤基质并摧毁TME 中的免疫抑制细胞。许多免疫原性差的肿瘤不能产生足够的抗原来产生强大的原发免疫反应，而肿瘤消融可用于产生大量的抗原，这些抗原可立即通过瘤内注射的APCs[13]进行处理。

瘤内ACT 和肿瘤消融的联合治疗策略已经进行了临床前研究。Machlenkin 等[14]在肺癌和黑色素瘤的小鼠模型中使用冷冻治疗和注射树突细胞，虽然单独的树突状细胞治疗增加了CD8+T 细胞的增殖，但只有联合治疗产生效应记忆细胞。接受联合治疗的小鼠存活时间更长，对随后的肿瘤复发具有更强的抵抗力，表明联合治疗具有持久的免疫反应。该研究主要优势是使用了未成熟的未负载树突状细胞。目前的树突状细胞ACT 大多采用装载肿瘤抗原或体外转基因的成熟树突状细胞，增加了研究的复杂性。相比之下，该研究中使用的树突状细胞不需要装载抗原，可操作性高，可节省大量的时间和成本。此外，成熟的、装载抗原的树突状细胞交叉呈现抗原和诱导抗原扩散的能力可能较弱，而这对持久的免疫介导反应[15]至关重要。

Udagawa 等[16]在瘤内注射小鼠转移性结肠癌模型之前用卡介苗细胞壁骨架（BCG-CWS）短暂培养树突状细胞。与未成熟的树突状细胞相比，培养的树突状细胞治疗的小鼠肿瘤浸润性CD8+T 细胞增加。此外，肿瘤的消退和对肿瘤再复发的抵抗力也显著增强。该研究表明存在原始抗原的树突状细胞更适合用于瘤内免疫治疗联合消融。Nakagawa 等[17]在这一领域进行了进一步的研究，发现了一种从A 族链球菌中提取的新型制剂OK432，通过TLR3、TLR4 和B2 整合素刺激树突状细胞，基于早期使用经肝动脉靶向治疗的研究，使用OK432 刺激的树突状细胞联合消融治疗肝细胞癌（HCC）。临床前研究中OK432 刺激的树突状细胞的疗效显著，随后进行了第一项人体随机Ⅰ/Ⅱ期临床试验[18]。在这项试验中，30 例患者在RFA时随机接受未成熟树突状细胞或OK432 刺激树突状细胞的瘤内注射，接受刺激树突状细胞治疗的患者无复发生存期明显更长，但总生存期没有显著差异。关于乳腺癌消融研究[19]中直接注射OK432 也有类似的抗肿瘤免疫反应，OK432 在体直流电刺激是否与体外刺激一样有效还有待确定，但已有发现其具有进一步研究的价值。

虽然有明确的理论基础将消融和抗原提呈细胞为基础的治疗相结合，但很少有研究评估非抗原提呈免疫细胞联合消融治疗的效果。Lin 等[20]研究了异体NK 细胞联合不可逆电穿孔治疗局部晚期胰腺癌，12 例中有6 例在联合治疗后无进展和总生存期得到改善。Alnaggar 等[21]在Ⅳ期肝细胞癌患者中进行了类似的Ⅰ期研究，显示了相对适度的生存获益。但非抗原提呈细胞介导的瘤内细胞过继疗法和消融联合治疗并没有实质性的疗效。

1.3 模式识别受体（PRR）激动剂PRR 主要由抗原提呈细胞表达，能够调节病原体的炎症反应。PRR的作用是识别感染环境下的病原体相关分子模式（PAMPs），以及应激或死亡细胞释放的内源性细胞DAMPs。瘤内PRR 激动剂联合消融具有明显的协同作用潜力。通过将PRR 激动剂运送到消融部位，可能起到原位疫苗佐剂的作用，增强消融部位释放的抗原的免疫应答作用。Behm 等[22]对于RFA 和瘤内注射CpG-ODN 的研究证实经RFA 和CpG-ODN治疗的肝细胞癌的兔存活时间明显更长，远处转移较少。但单独使用CpG-ODN 治疗会导致Th1 免疫刺激细胞因子（如IL-2 和IFNy）和免疫抑制细胞因子（如IL-10）的上调，会产生整体的耐药免疫表型。消融治疗诱导了DAMPs 的释放，如热休克蛋白，与CpG-ODN 相结合，促进了强大的Th1 免疫反应。den Brok 等[23]在小鼠黑色素瘤模型中使用冷冻消融和TLR9 激动剂产生了类似结果，并对协同作用机制做了详细阐述。单独消融导致肿瘤引流淋巴结中的树突状细胞成为抗原载体，但TLR9 激动剂的加入导致CD80 表达增加，提示树突状细胞成熟及增殖。此外，联合治疗组小鼠的树突状细胞能够有效地将抗原交叉呈递给MHC 限制的T 细胞亚群。

尽管Toll 样受体（TLR）激动剂有望与肿瘤消融联合使用，但可能会引起明显的脱靶效应。TLR激动剂在某些肿瘤类型和T 细胞亚群上有表达，通过这些细胞受体发出信号可以促进肿瘤增殖和免疫逃避。下游免疫效应取决于靶向TLR 激动剂的类型，如TLR4 激动剂增强免疫抑制调节性T 细胞的增殖和活性，而TLR1/2 和TLR8 激动剂降低Tregs[24]的抑制作用。平衡TLR 激动剂复杂的下游效应是影响其临床潜力的主要因素。

相关研究正在评估其他PRR 途径的治疗潜力。干扰素基因激动剂（STING）是一种细胞内PRR，可识别胞质DNA 并刺激1 型干扰素的产生。STING途径主要通过宿主免疫细胞摄取和对肿瘤源性DNA 的识别，在内源性抗肿瘤先天免疫中发挥核心作用。激活该通路可诱导产生1 型干扰素，并通过1 型干扰素调节广泛的局部和全身免疫功能，包括DC 成熟、T 细胞启动、趋化性和进一步的细胞因子产生[25]。STING 激动剂在临床前研究中显示出抗肿瘤作用[26]；由于这些药物的免疫刺激作用最初发生在肿瘤微环境中的树突状细胞的细胞质中，增强其效果的一种新方法是与不可逆性电穿孔结合，这种结合理论基础是不可逆性电穿孔可渗透细胞膜，并允许阴离子STING 激动剂进入肿瘤细胞，树突状细胞吞噬装载STING 激动剂的濒死肿瘤细胞，此时通路受到刺激。有研究评估了STING/IRE 的联合治疗疗效并证实了其强大的协同作用。Go 等[27]使用小鼠肺癌模型证明，联合STING/IRE 导致TME中活化的DC、CD4+和CD8+T 细胞和M1 巨噬细胞增加，而M2 免疫抑制巨噬细胞减少。Lasarte-Cia等[28]在黑色素瘤和肝细胞癌模型中也显示了类似的结果。基于这些研究的初步数据和协同作用的明确机制基础，STING 和不可逆性电穿孔值得进一步研究。

1.4 生物材料越来越多的研究将合成生物材料用作免疫调节剂，其中许多新型材料适合局部给药。Zhou 等[29]开发了一种甘露糖衍生的碳点纳米颗粒，可促进肿瘤抗原向抗原提呈细胞的递送，并且表明纳米颗粒在肝细胞癌小鼠模型中有效地捕获了微波消融后释放的抗原和DAMP，在捕获抗原和损伤信号后，纳米颗粒靶向树突状细胞，刺激其成熟，并导致T 细胞活化增强，联合治疗后肿瘤消退显著和对肿瘤复发的抵抗力增强。使用装载有吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）抑制剂的磁性纳米簇，在注射纳米团簇后递送时会诱导局部磁场，从而增强直接肿瘤破坏并触发IDO 抑制剂的释放，诱导CD8+T细胞增加和浸润肿瘤的Treg 减少。先进生物材料能够在肿瘤治疗中发挥作用，并且可以设计用于增强现有的消融疗法的合成生物材料。

小分子合成生物材料在与消融结合的治疗策略的疗效也在研究中。Chen 等[30]将刺激树突状细胞吞噬的rho-associated kinase（ROCK）抑制剂与消融治疗后捕获肿瘤抗原的水凝胶聚合物结合。该聚合物导致树突状细胞抗原摄取增加，并在细胞质中逐渐释放ROCK 抑制剂，从而导致小鼠黑色素瘤模型中的肿瘤消退和小鼠存活率增加。Yang等[31]设计了一种基于双乳化脂氧化酶和Hemin 的治疗方法，在消融治疗后注射时，不断产生细胞毒性脂自由基，同时使用肿瘤碎片作为燃料。肿瘤杀伤、肿瘤燃料纳米反应器产生了更有效的残余局部肿瘤破坏，诱导多个小鼠细胞系的抗肿瘤免疫。Korbelik 等[32]将N-二氢半乳糖壳聚糖的变体在瘤周注射并与消融相结合，已被证明可通过多种机制诱导抗肿瘤免疫反应。该聚合物引起抗原隔离、APCs 的募集和刺激，从而诱导Th1 T 细胞免疫反应。

1.5 细胞因子瘤内细胞因子注射联合肿瘤消融也有相关研究报道。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）可激活APCs，并触发全身抗肿瘤反应。T-VEC 的潜在机制依赖于直接的病毒肿瘤溶解以及GM-CSF 介导的APC 刺激。将GM-CSF 或其他细胞因子与肿瘤消融结合的研究通过类似的机制产生抗肿瘤免疫效应。Chen 等[33]将肿瘤内GMCSF 微球与微波消融和CTLA-4 阻断相结合，证明了由CD4+、CD8+和NK 细胞介导的肿瘤特异性抗肿瘤免疫反应。其他研究中提到的IL-2[34]、IL-7和IL-15[35]联合消融在动物模型中显示出了一定效果，这种治疗在小鼠结肠癌模型中诱导了肿瘤消退和免疫记忆。

2 机遇和挑战

瘤内免疫治疗联合肿瘤消融给肿瘤治疗带来了独特的机遇和挑战，联合治疗策略在临床前研究的疗效方面取得了实质性进展，虽已完成的转化研究很少，但成果显著。联合治疗模式在日益复杂和有效的免疫治疗模式中发挥的作用仍然存在疑问。随着新的免疫治疗药物的开发，在无法耐受全身给药的情况下，研究瘤内免疫治疗及肿瘤消融治疗是目前研究的热点。

CI 已被证实在免疫原性差的肿瘤中疗效有限，特别是免疫沙漠表型[36]的肿瘤。这些肿瘤的特点是肿瘤突变低，抗原数量少，T 细胞启动差，导致肿瘤浸润效应T 细胞（TIL）总体缺乏。在免疫原性较差的肿瘤中，利用瘤内免疫和消融联合促进TIL 浸润的方法可能有益于CI 的联合应用[37]。很少有临床试验同时研究瘤内免疫治疗和消融联合全身治疗。荷兰研究者联合使用IRE、nivolumab 和一种瘤内TLR9 激动剂，目前正在招募（PANFIRE-3）中[38]。更复杂的多模式疗法，虽然实施起来具有挑战性，但在理论上是可行的。

目前需要有效的、潜在的影像学方法来评估这种情况下的治疗反应（如ctDNA），尽管存在挑战，转移性疾病患者尤其有可能受益于HIT-IT 和消融联合诱导的免疫反应。