白术内酯III通过调节JAK2/STAT3信号通路减轻溃疡性结肠炎模型小鼠肠道损伤*

鲁慧东， 李艳梅

（1赤峰市医院消化内科，内蒙古 赤峰 024000；2内蒙古医科大学附属医院消化内科，内蒙古 呼和浩特 010110）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis， UC）作为一种发生于结肠的慢性非特异性炎症性疾病，发病率逐年升高，以腹泻、血便及体重减轻等为主要临床症状，肠道损伤是其病理基础，其易反复发作且难以治愈，严重困扰着患者的正常生活和工作［1-2］。目前，UC病因尚不明确，既往研究认为其可能受遗传、环境、免疫及肠道菌群等多因素影响，且若UC治疗不及时，可能增加肿瘤形成的风险［3-4］。因此，积极探究UC发病机制并开发有效治疗药物具有实际意义。

白术内酯 III（atractylenolide III， AT III）是白术根提取物中的主要生物活性化合物之一，具有抗炎和抗氧化应激等多种药理作用［5-6］。已有研究显示白术内酯III可通过激活腺苷酸激活蛋白激酶/沉默信息调节因子1/过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α信号通路缓解UC中线粒体功能障碍［7］。此外，多项研究［8-9］表明，Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信号转导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）信号通路参与UC发生及病变缓解。另有研究证实白术内酯III可改善小胶质细胞JAK2/STAT3/发动蛋白相关蛋白1（dynamin-related protein 1， Drp1）依赖性线粒体分裂相关的脑缺血性损伤和神经炎症［10］。然而，白术内酯III是否可通过调节JAK2/STAT3信号通路缓解UC模型小鼠肠道损伤尚无相关报道。基于此，本研究采用葡聚糖硫酸钠（dextran sulfact sodium，DSS）诱导UC小鼠模型，探究白术内酯III对UC小鼠肠道损伤的影响及JAK2/STAT3信号通路在此过程中的作用。

材料和方法

1 动物

48只6周龄无特定病原体级健康雄性C57BL/6小鼠，体重18～22 g，购自北京北方艾特生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2020-0005。在标准实验室条件下饲养，温度（22±1）℃，湿度45%～55%，光/暗循环12 h∶12 h，自由获取鼠粮和无菌水。所有动物都按照《实验室动物护理和使用指南》进行护理，同时本研究获得本院动物实验伦理委员会批准。

2 主要试剂

DSS（纯度99%， MP Biomedicals）；白术内酯III（纯度99.91%， MCE）；香豆霉素A1（一种JAK2激活剂，纯度≥95%，上海翌圣生物科技股份有限公司）；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒、过碘酸雪夫（Periodic Acid-Schiff，PAS）染色试剂盒、DAB试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司）；小鼠白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-4、IL-6、IL-10酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；兔源I抗闭锁小带蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）、闭合蛋白（occludin）、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体及II抗辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔 IgG（Abcam）。

3 主要方法

3.1 分组、造模与给药 48只C57BL/6小鼠适应性饲养一周后，按照随机数字表法随机分为正常（normal）组、模型（model）组、白术内酯III（低、中、高）剂量（AT III-L、AT III-M、AT III-H）组和白术内酯III+JAK2激活剂（AT III+CA1）组，每组各8只。除正常组小鼠自由饮用蒸馏水外，其余各组小鼠自由饮用2.5%（2.5 g/100 mL）DSS水溶液连续7 d构建UC模型［11］，随后将DSS水溶液换成蒸馏水。同时于造模第1天开始，参照文献［7，12-13］及预实验结果（白术内酯III使用剂量为5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg时，小鼠均无不良反应），白术内酯III（低、中、高）剂量组分别尾静脉注射 5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg白术内酯III，每天1次，连续7 d；白术内酯III+JAK2激活剂组同一时间尾静脉注射15 mg/kg 白术内酯III和1 mg/kg香豆霉素A1；正常组和模型组同一时间给予等量蒸馏水。

3.2 一般情况观察 实验期间，每天观察并详细记录小鼠的活动、毛发色泽、精神状态、粪便性状和隐血/便血情况以及体重变化等。并根据体重变化、粪便性状和隐血/便血情况，计算疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分，评分标准见表1。

表1 DAI评分标准Table 1. DAI scoring scale

3.3 样品采集 末次给药后，禁食24 h，麻醉后脱颈处死小鼠，分离回盲部到肛门的结肠组织，测量结肠长度，并将结肠组织分成两份，一份置于4%多聚甲醛中固定；另一份置于液氮中速冻过夜，随后转移到-80 ℃超低温冰箱保存备用。

3.4 HE染色检测结肠组织病理学变化 于4%多聚甲醛中固定24 h后，将结肠组织石蜡包埋，制备成常规石蜡切片（4 μm厚），HE染色后于光学显微镜下观察结肠组织病理学变化。每张切片随机选取5个视野（高倍镜，×400），通过双盲法进行组织病理学评分（评分标准参考文献［11］所述方法），取平均值作为最终结果。

3.5 PAS染色检测结肠组织中杯状细胞 4 μm厚的结肠组织石蜡切片进行常规脱蜡和水化，加入高碘酸溶液室温孵育1 h，蒸馏水洗涤后加入Schiff溶液37 ℃孵育20 min，流水冲洗后苏木精复染2 min，盐酸乙醇分化5 s，返蓝后脱水、透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察染色结果并拍照。

3.6 免疫组化法检测结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1和occludin表达 4 μm厚的结肠组织石蜡切片经脱蜡和水化后，于柠檬酸缓冲液中加热10 min以进行抗原热修复，室温下用山羊血清封闭15 min后用I抗（ZO-1、occludin抗体）在4 ℃下孵育过夜，使用HRP标记的Ⅱ抗室温孵育1.5 h，DAB显色，苏木精复染，返蓝后脱水、透明、封片。每张切片随机选取5个视野（高倍镜，×400）拍照，采用Image J软件半定量分析蛋白表达，蛋白表达量以阳性蛋白所占面积表示。

3.7 ELISA法检测结肠组织中炎症因子水平 取结肠组织，制备匀浆液，BCA法对蛋白浓度进行定量，按照ELISA试剂盒说明书分别测定结肠组织匀浆液中IL-1β、IL-4、IL-6和IL-10水平。

3.8 Western blot法检测结肠组织中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达 添加裂解液于冰上充分裂解结肠组织，离心后吸取上清液，BCA法对蛋白浓度进行定量。各样品取20 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后将分离的蛋白转至聚偏二氟乙烯膜，5%牛血清白蛋白室温封闭1 h后加入Ⅰ抗（JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、GAPDH抗体）4 ℃孵育过夜，PBS洗涤后加入Ⅱ抗（HRP标记的山羊抗兔IgG）室温孵育1.5 h，PBS洗涤后化学发光法显色。ImageJ软件分析各蛋白条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量（GAPDH为内参蛋白）。

4 统计学处理

应用Graphpad Prism 8软件分析实验数据。数据以均数±标准差（Mean±SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两组间比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 白术内酯III对UC小鼠一般情况的影响

正常组小鼠活动正常，毛发有光泽，精神状态良好，粪便成形，无隐血/便血，体重呈上升趋势；模型组小鼠活动逐渐减少，毛发失去光泽，精神萎靡，部分粪便呈稀水样，粪便隐血阳性或肉眼可见便血，体重明显下降；白术内酯III（低、中、高）剂量组小鼠上述表现均存在不同程度的改善，且白术内酯III高剂量组改善最为明显；白术内酯III+JAK2激活剂组小鼠上述表现介于白术内酯III高剂量组和模型组之间。

2 白术内酯III对UC小鼠体重变化和DAI的影响

实验结束时，与正常组相比，模型组小鼠体重显著降低，DAI评分显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，白术内酯III（低、中、高）剂量组小鼠体重显著升高，DAI评分显著降低（P＜0.05），且呈现剂量依赖性；与白术内酯III高剂量组相比，白术内酯III+JAK2激活剂组小鼠体重显著降低，DAI评分显著升高（P＜0.05）。见图1。

Figure 1. Effects of atractylenolide III on body weight change （A） and DAI（B） in UC mice. Mean±SD. n=8. *P＜0.05 vs normal group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs AT III-H group.图1 白术内酯III对UC小鼠体重变化和DAI的影响

3 白术内酯III对UC小鼠结肠长度和组织病理学变化的影响

HE染色结果显示，正常组小鼠结肠组织结构完整且未见炎症细胞浸润；模型组小鼠肠壁结构严重破坏，腺体变形甚至消失，杯状细胞丢失，可见大量炎症细胞浸润；白术内酯III（低、中、高）剂量组小鼠上述病理损伤逐渐改善，其中白术内酯III高剂量组改善最为明显；白术内酯III+JAK2激活剂组小鼠上述病理损伤较白术内酯III高剂量组加重，见图2。与正常组相比，模型组小鼠结肠长度显著缩短，组织病理学评分显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，白术内酯III（低、中、高）剂量组小鼠结肠长度显著增加，组织病理学评分显著降低（P＜0.05），且呈现剂量依赖性；与白术内酯III高剂量组相比，白术内酯III+JAK2激活剂组小鼠结肠长度显著缩短，组织病理学评分显著升高（P＜0.05）；见表2。

表2 白术内酯III对UC小鼠结肠长度和组织病理学变化的影响Table 2. Effects of atractylenolide III on colon length and histopathological changes in UC mice （Mean±SD. n=8）

Figure 2. Effects of atractylenolide III on histopathological changes of colon in UC mice. The scale bar=200 μm.图2 白术内酯III对UC小鼠结肠组织病理学变化的影响

4 白术内酯III对UC小鼠结肠组织中杯状细胞的影响

杯状细胞位于小鼠结肠黏膜上皮和肠腺上皮之间，呈酒杯状，主要作用是分泌黏液，PAS染色可将杯状细胞中的黏液素染成紫红色。与正常组相比，模型组小鼠结肠组织中杯状细胞数量减少，颜色变浅；而与模型组相比，白术内酯III（低、中、高）剂量组小鼠结肠组织中杯状细胞数量增多，颜色加深，且白术内酯III高剂量组变化最为明显；与白术内酯III高剂量组相比，白术内酯III+JAK2激活剂组结肠组织中杯状细胞数量减少，颜色变浅。见图3。

Figure 3. Effects of atractylenolide III on goblet cells in colon tissue of UC mice. The scale bar=50 μm.图3 白术内酯III对UC小鼠结肠组织中杯状细胞的影响

5 白术内酯III对UC小鼠结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1和occludin表达的影响

免疫组化染色结果显示，ZO-1和occludin蛋白阳性在结肠组织中呈棕黄色染色，主要表达于肠上皮细胞，位于细胞质。统计学分析显示，与正常组相比，模型组小鼠结肠组织中ZO-1和occludin蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，白术内酯III（低、中、高）剂量组小鼠结肠组织中ZO-1和occludin蛋白表达显著升高（P＜0.05），且呈现剂量依赖性；与白术内酯III高剂量组相比，白术内酯III+JAK2激活剂组小鼠结肠组织中ZO-1和occludin蛋白表达显著降低（P＜0.05）。见图4。

6 白术内酯III对UC小鼠结肠组织中炎症因子水平的影响

ELISA检测结果显示，与正常组相比，模型组小鼠结肠组织中IL-1β和IL-6水平显著升高，IL-4和IL-10水平显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，白术内酯III（低、中、高）剂量组小鼠结肠组织中IL-1β和IL-6水平显著降低，IL-4和IL-10水平显著升高（P＜0.05），且呈现剂量依赖性；与白术内酯III高剂量组相比，白术内酯III+JAK2激活剂组小鼠结肠组织中IL-1β、IL-6水平显著升高，IL-4和IL-10水平显著降低（P＜0.05）。见表3。

表3 白术内酯III对UC小鼠结肠组织中炎症因子水平的影响Table 3. Effects of atractylenolide III on the levels of inflammatory factors in colon tissue of UC mice （ng/g. Mean±SD. n=8）

7 白术内酯III对UC小鼠结肠组织中JAK2、p-JAK2、STAT3及p-STAT3蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示，与正常组相比，模型组小鼠结肠组织中JAK2、p-JAK2、STAT3及p-STAT3蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，白术内酯III（低、中、高）剂量组小鼠结肠组织中JAK2、p-JAK2、STAT3及p-STAT3蛋白表达显著降低（P＜0.05），且呈现剂量依赖性；与白术内酯III高剂量组相比，白术内酯III+JAK2激活剂组小鼠结肠组织中JAK2、p-JAK2、STAT3及p-STAT3蛋白表达显著升高（P＜0.05）。见图5。

讨 论

虽然目前用于UC临床治疗的药物种类繁多，但现有的治疗手段仍无法完全治愈，多数患者须终身服药，同时也伴有一定副作用，给患者带来沉重的经济和心理负担，UC已被世界卫生组织列为现代难治病之一［14］。因此，本研究通过构建UC动物模型，旨在筛选一种治疗UC的潜在药物。

Figure 4. Effects of atractylenolide III on the expression of tight junction proteins ZO-1 and occludin in colon tissue of UC mice. The scale bar=200 μm. Mean±SD. n=8. *P＜0.05 vs normal group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs AT III-H group.图4 白术内酯III对UC小鼠结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1和occludin表达的影响

目前，国内外对UC动物模型的选择尚不统一，其中大鼠和小鼠是最常用的动物，且造模的方法也各有差异。为保证实验的稳定性和可靠性，本研究采用自由饮用2.5% DSS水溶液连续7 d构建C57BL/6小鼠UC模型，此方法简便廉价、维持性好、易于复制、成功率高、便于直观观察造模成功与否，且DSS诱导的UC类似于人类UC发病机制和临床表现［15］。本研究成功构建了UC小鼠模型，具体表现为精神萎靡，粪便呈稀水样，粪便出现隐血或便血，体重下降等现象，且DAI评分升高，结肠长度缩短，结肠组织出现明显病理损伤，与文献报道［15］一致。而本研究采用白术内酯III治疗UC小鼠后，UC小鼠的上述病变表现均存在不同程度改善，表明白术内酯III可能对UC小鼠具有较好治疗效果。

据大量文献报道，肠屏障损伤与UC的发生和进展关系密切，而紧密连接结构作为肠屏障的最重要组成部分，对于维持肠屏障的正常功能至关重要。肠屏障紧密连接结构破坏后，肠黏膜通透性增加，促使各种病原微生物和大分子物质进入机体，引起一系列炎症反应，而当炎症反应发生后，杯状细胞受损，从而减少肠道上皮细胞表面的黏液分泌，进一步增加了上皮细胞与各种病原微生物的接触［16］。ZO-1、occludin是肠屏障紧密连接结构中的重要蛋白，其表达和分布可用来判断结肠的肠屏障功能［17］。抗炎因子IL-4、IL-10和促炎因子IL-1β、IL-6在UC炎症反应中扮演着重要角色［9，18］。本研究结果显示，白术内酯III可改善UC引起的小鼠结肠组织中ZO-1、occludin、IL-4、IL-10水平下降，IL-1β、IL-6水平上升以及杯状细胞数量减少。表明白术内酯III可调节肠屏障紧密连接结构，减轻炎症反应，缓解UC小鼠肠道损伤。Han等［7］研究也证实了白术内酯III可减轻UC症状，抑制炎症和氧化应激，并恢复UC小鼠结肠上皮屏障的破坏，本研究结果与其一致。

Figure 5. Effects of atractylenolide III on the expression of JAK2， p-JAK2， STAT3 and p-STAT3 proteins in colon tissues of UC mice. Mean±SD. n=8. *P＜0.05 vs normal group； #P＜0.05 vs model group； △P＜0.05 vs AT III-H group.图5 白术内酯III对UC小鼠结肠组织中JAK2、p-JAK2、STAT3及p-STAT3蛋白表达的影响

白术内酯III的抗炎作用虽已在多项研究中得到证实，但是，其减轻炎症反应并缓解肠道损伤的机制仍很大程度上未知。因此，本研究探索了与机体炎症反应密切相关的通路—JAK2/STAT3信号通路在白术内酯III缓解UC小鼠肠道损伤中的作用。JAK2是非受体型酪氨酸蛋白酶家族成员之一，其在细胞因子和生长因子刺激作用下激活，活化后的JAK2进一步激活下游STAT3（一种脱核苷酸结合蛋白），各种靶蛋白的酪氨酸残基促使膜外刺激信号传导到细胞内后引起JAK2、STAT3磷酸化，p-STAT3转移到细胞核后调控基因转录、翻译［19］。本研究Western blot结果显示，UC小鼠结肠组织中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达显著升高，提示UC诱导JAK2/STAT3信号通路激活；而白术内酯III治疗后，UC小鼠结肠组织中JAK2/STAT3信号通路激活受到抑制，表明白术内酯Ⅱ缓解UC小鼠肠道损伤，可能与抑制JAK2/STAT3信号通路激活有关。香豆霉素A1是一种JAK2信号激活剂，可激活JAK2/STAT3信号通路［20］。本研究在白术内酯Ⅱ治疗基础上给予香豆霉素A1，结果显示香豆霉素A1可激活结肠组织中JAK2/STAT3信号通路，同时减弱白术内酯III对UC小鼠肠道损伤的缓解作用，这进一步证实了白术内酯III可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路激活缓解UC小鼠肠道损伤。既往文献也报道，抑制IL-6/JAK2/STAT3信号传导可恢复结肠组织中Treg和Th17细胞的稳态，从而减轻DSS诱导的UC［21］。

综上所述，白术内酯III能够抑制JAK2/STAT3信号通路激活，减轻局部炎症反应，缓解UC小鼠肠道损伤。本研究为UC的防治提供了新的实验依据。