中国草原红牛不同部位肌纤维特性及类型

关诗宇，谷兴亮，沈宏旭，马玉敏，程 雷，曲 磊，秦立红,*

（1.吉林省农业科学院（中国农业科技东北创新中心），吉林 长春 130033；2.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118；3.洮南市畜牧总站，吉林 白城 137100）

肌纤维组织学的特性决定肉用品质的好坏，肌肉由肌纤维组成，也是骨骼肌的基本单位。随着生活水平与质量的不断提高，人们的肉品质选择标准也不断升高，因此掌握优良肉牛品种的不同肉质性状是肉牛养殖应当解决的问题。研究表明，肌纤维半径与横截面积可以影响肌肉生长和肉质的优劣[1]。肌外膜、肌内膜和肌束膜共同构成肌内结缔组织。在肌肉的外围被肌外膜所覆盖；每个相邻的肌肉纤维间由肌内膜相连，形成肌束[2]；肌束膜紧紧将相邻的不同肌束连接到一起。肌外膜在屠宰分割的过程中已经剔除[3]，对肌纤维组织学特性的研究没有影响。肌内膜与肌束膜为紧紧包裹在肌纤维与肌束外的一层结缔组织，对肌肉的嫩度有一定影响[4]。苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色法依据苏木素染色液可以将细胞核染成淡蓝色，酸性的伊红溶液能够将胞浆呈现为红色，从组织水平对肌肉组织纤维特性及形态学差异进行研究，最直观反映肌肉组织结构与功能变化规律，进而达到观察肌肉组织的目的[5]。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸四唑氧化还原酶（nicotinamide adenine dinucleotide tetrazolium oxidoreductase，NADH-TR）组织化学染色法是区分肌肉中不同肌纤维类型的主要方法之一[6]。肌肉由不同类型的肌纤维组成，依据肌纤维生理生化、形态学特征及组织化学的反应，通过NADH-TR染色将肌肉纤维分为Ⅰ型慢收缩氧化型、ⅡA型和ⅡB型快收缩氧化型肌纤维。中国草原红牛是经本地牛与英国短角牛杂交培育而成的乳肉兼用的新品种[7]，主要分布于吉林省西部和内蒙古等地区，具有耐粗饲、抗寒、抗逆性强、肉质好等特性。

关于肌纤维组织学特性，在鸡、猪、鹅、羊等家畜中研究较为广泛[8-12]。万磊等[13]研究发现，宁都黄鸡不同部位肌内膜与肌束膜厚度存在差异。侯小伟[14]比较不同地区的乌珠穆沁羊，发现不同部位间的肌束膜与肌内膜的结缔组织存在差异。关于牛的肌纤维组织学特性也有报道研究。王金泉等[15]对新疆褐牛与土黄牛间不同部位肌纤维面积进行比较分析，结果显示，不同品种牛间相同部位肌纤维横截面积存在差异。桂干北等[16]对去势公牛的不同部位肉品质进行比较，结果显示，去势公牛不同部位的肌肉理化特性存在显著差异。Morgan等[17]对牛14 个不同部位的肌束膜与嫩度进行比较，结果显示，肌束膜厚度与肉品质嫩度呈现负相关。Brooks等[18]分割牛不同部位，比较肌束膜与嫩度发现，肌束膜厚度与牛肉嫩度之间有一定的相关性，且分割宰后成熟过程中肌束膜的变化也各有不同。

本研究通过对中国草原红牛的肌纤维组织进行HE和NADH-TR染色，进而对不同部位间肌肉组织学特性和肌纤维类型组成的占比进行比较分析，旨在探究草原红牛肌肉发育进程中的组织学差异，为培育肉质品质优良的肉牛品种提供依据，同时也可以为满足消费者对不同品质牛肉的需求提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选取日龄、体质量及饲养环境均一致的中国草原红牛6 头，在相同时间内进行统一屠宰，严格参照GB/T 19477ü2004《牛屠宰操作规程》屠宰操作规范进行屠宰。

二甲苯 国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇成都博瑞特化学技术有限公司；曙红Y（醇溶） 上海生工有限公司；苏木素、抗荧光衰减封片剂 北京索莱宝科技有限公司；NADH、氯化硝基四氮唑蓝 美国Sigma公司；OTC冷冻包埋剂 日本Sakura公司。

1.2 仪器与设备

DW-86L80 -80 ℃超低温冰箱 浙江捷盛公司；BCD-170WLDPC冰箱（-20 ℃） 海尔公司；Histo Core MULTICUT石蜡切片机、Histo Core Arcadia H组织包埋机、CM1950冷冻切片机 德国Leica公司；DHG-9123A电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；GG-43普通培养箱 赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌肉样本采集

统一屠宰后，迅速采集西冷、大条、米龙、上脑、小条及牛腩不同部位肌肉组织样本各500 g，采取液氮保存运送方法，快速运送至实验室，-80 ℃冰箱中进行长期保存。

1.3.2 切片制备与HE染色

从采集的液氮保存肌肉样本上沿肌纤维纹路分割成约为1 cmh1 cmh1 cm 的冷冻肌肉组织样品。将处理好的样品在多聚甲醛溶液中固定24 h；依据常规方法[19]操作进行冰冻切片包埋、切片脱蜡至水；随后进行HE染色，染色后对切片进行脱水、透明、封片处理，等待玻片室温晾干后，在玻片扫描影像系统中进行扫描观察。

1.3.3 冰冻切片与NADH-TR染色

将采集到的冷冻肌肉组织样本切割修整为约1 cmh1 cmh1 cm的组织样本。将不同部位组织样本放入液氮中速冷处理，用甲醛溶液固定，同时进行NADH-TR染色[20]；封片，室温晾干后放置于全景扫描影像系统中全片扫描。

1.3.4 切片的观察和数据测量

将HE与NADH-TR染色晾干的玻片放置于全景扫描影像系统中进行全片扫描。同时在HE染色不同部位肌肉样品切片中各随机挑选30 个肌纤维横截面积，用Image J软件进行肌纤维横截面积的测量；通过Image Viewer G软件在100×视野下随机挑选不同部位各30 个相邻肌束间测量肌束膜厚度，随机挑选测量30 个肌束内相邻的肌纤维间的距离。NADH-TR染色组织切片在相同视野（100×）下，通过Image pro plus软件进行不同肌纤维类型的计数。

1.4 数据处理

通过Excel进行不同肌纤维类型的占比统计；利用SPSS 20.0软件对所得实验数据平均值进行统计学分析，结果显示为平均值±标准差，采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著，P＞0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 草原红牛不同部位肌纤维HE染色切片

图1所示，经HE染色后的肌肉切片呈现淡蓝色、红色或无色，淡蓝色为肌肉纤维细胞核，同时可以清晰看见肌纤维间交错分布的肌内膜和存在于肌束间宽阔纵横的肌束膜。肌内膜为包裹在肌纤维外的一层结缔组织，肌内膜厚度为2 个相邻肌纤维间结缔组织的厚度。一个肌束由几十条肌纤维聚集成束形成肌束，肌束膜则是包裹在肌束外的一层结缔组织。

图1 不同部位肌纤维HE染色切片（×100）Fig. 1 HE staining images of muscle fibers from different parts (× 100)

2.2 草原红牛不同部位肌肉NADH-TR染色切片

由图2可知，肌肉切片经过NADH-TR染色后呈现出颜色深浅不一，Ⅰ型肌纤维染色为深蓝色，ⅡB型肌纤维染色为淡蓝发白灰色，介于2 种颜色之间的为ⅡA型肌纤维。由于不同部位肌肉肌纤维特性差异，染色后的肌肉切片中不同类型肌纤维交错分布，不同部位间肌纤维占比也各有不同。

图2 不同部位肌纤维NADH-TR染色切片（×100）Fig. 2 NADH-TR staining images of muscle fibers from different parts (× 100)

2.3 草原红牛不同部位肌纤维组织学特性

由表1可知，上脑部位平均肌纤维直径与横截面积分别为75.41 μm和4 570.35 μm2，但与其他部位差异不显著；米龙部位平均肌纤维直径与横截面积均小于其他部位。草原红牛不同部位肌肉样本肌纤维直径与横截面积均差异不显著。牛腩部位肌束膜厚度平均为109.03 μm，极显著高于其他部位（P＜0.01）；西冷部位肌束膜厚度平均为25.99 μm，极显著低于其他部位（P＜0.01）；大条部位平均肌束膜厚度为64.64 μm，与米龙、上脑、小条相比差异极显著（P＜0.01）。米龙、上脑、小条部位间的肌束膜厚度差异不显著。西冷部位肌内膜厚度为5.49 μm，极显著低于米龙、上脑、小条和牛腩部位肌内膜厚度（P＜0.01）；大条部位肌内膜厚度与西冷部位相比差异不显著，大条部位与米龙、上脑、牛腩部位相比差异显著（P＜0.05）；米龙、上脑、牛腩相比差异不显著，米龙与小条部位肌内膜厚度相比差异极显著（P＜0.01）；上脑部位肌内膜厚度平均为13.47 μm，与小条部位相比差异极显著（P＜0.01）。

2.4 草原红牛不同部位肌纤维类型组成占比

由表2可知，不同部位的肌纤维类型组成占比有所不同。对于Ⅰ型肌纤维，西冷部位占比为48.29%，极显著高于大条、米龙、上脑、牛腩部位（P＜0.01）；牛腩部位占比为22.39%，极显著低于其他所测5 个部位（P＜0.01）；大条与米龙、上脑相比Ⅰ型肌纤维占比差异显著（P＜0.05）；小条部位Ⅰ型肌纤维占比为43.09%，显著高于米龙、上脑（P＜0.05）；米龙部位与上脑部位间Ⅰ型肌纤维占比无明显差异。对于ⅡA型肌纤维，草原红牛的不同部位间无明显差异。对于ⅡB型肌纤维，牛腩部位占比为49.92%，极显著高于其他部位（P＜0.01）；米龙部位ⅡB型肌纤维占比为35.93%，与大条、上脑部位相比差异极显著（P＜0.01），与小条部位无明显差异；西冷部位ⅡB型肌纤维占比为30.21%，极显著低于其他部位（P＜0.01）；大条部位与上脑部位间差异显著（P＜0.05）。

表2 不同部位肌纤维组织类型组成占比Table 2 Proportion of muscle fiber types in different parts %

3 讨 论

3.1 肌纤维直经与横截面积

肌纤维直径与横截面积为肌肉组织学特性的一部分。肌纤维直径的大小可以影响肉质性状[21]，在本研究中二者均无明显差异，且不同部位间差异不显著，但与陈玲等[22]的研究结果有所不同，这可能是由于牛品种不同的原因。Solomon等[23]的研究显示，通过对猪、牛、羊等动物的日粮进行限制饲喂可以对肌纤维直径的减小产生影响。本研究测得的草原红牛肌纤维平均直径为69.8 μm，这与陈俐静等[24]所测得的安格斯牛的肌纤维直径32.86 μm、新疆褐牛肌纤维直径41.52 μm相比要大。说明草原红牛的肌纤维嫩度较低，在育种改良上可以着重改进草原红牛的嫩度。肌纤维直径与横截面积的不同可能与性别因素有关，欧秀琼等[25]的研究证明，在不同性别的长荣猪之间，母猪的肌纤维面积在前期的生长发育过程中要大于同一时期的公猪，但在生长后期，公猪的肌纤维横截面积、直径则要远超同一时期的母猪。不同品种、性别及营养水平均会造成肌纤维直径与横截面积的差异，本研究虽无明显差异，但也为草原红牛的肉质改进提供了依据。

3.2 肌纤维结缔组织

肌纤维结缔组织包括肌外膜、肌内膜和肌束膜，肌外膜通常在屠宰时剔除，因此不考虑。肌内膜包裹肌纤维，肌束膜包裹由几十个肌纤维聚集而成的肌束，肌内膜为细微波状胶原纤维构成的网状结构，肌束膜则为粗高波状胶原网状结构[13]。肌内膜在肌肉样本中为网状，分布于肌肉纤维间，影响肌肉嫩度[26]。而肌纤维横截面积的变化也与结缔组织的生长有关。本研究中，牛腩肌束膜厚度极显著高于其他部位，而西冷部位极显著低于其他部位，可能与不同部位嫩度不同有关[27]。嫩度与肌肉结缔组织的厚度呈现负相关，且在宰后成熟过程中随着时间的延长结缔组织会逐渐降解，导致呈现网状结构的肌束膜与肌内膜逐渐被破坏，改变肌肉品质的嫩度[28-29]。在本研究中，牛腩肌束膜厚度高于其他部位，说明牛腩部位的嫩度比较低，肌纤维横截面积与嫩度呈现负相关，则牛腩部位肌纤维横截面积较大。西冷部位肌内膜厚度小于其他部位，说明草原红牛的西冷部位嫩度较高。

3.3 肌纤维类型组成占比

通过NADH-TR染色，将肌肉纤维分为Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型，由于草原红牛在运动过程中不同部位的肌肉发挥不同的作用，来满足动物机体不同的生理功能，这也直接影响不同肌肉中肌纤维的组成占比。在本研究中，草原红牛不同部位间的Ⅰ型肌纤维占比由大到小依次为：西冷、小条、米龙、上脑、大条、牛腩；而ⅡB型肌纤维占比由大到小依次为：牛腩、上脑、大条、小条、米龙、西冷；Hwang等[30]的研究表明，韩牛肌肉的ⅡB型肌纤维比例与剪切力呈正相关，Ⅰ型肌纤维占比与剪切力呈负相关；在本研究中，西冷部位Ⅰ型肌纤维占比最大，牛腩部位最小，与剪切力呈负相关，则西冷部位剪切力与其他所测部位相比较小；肌肉的嫩度可以通过剪切力来判定，剪切力与嫩度呈负相关，因此西冷部位嫩度较高。但在Joo等[31]的研究中发现，肌纤维类型的组成比例与肉质的嫩度关系较为复杂，在形成过程中，肌纤维类型受运动方式和强度大小等多种因素的影响。

4 结 论

本研究对中国草原红牛的不同部位肌肉纤维分别进行HE染色与NADH-TR染色，对染色后肌肉切片的结缔组织厚度、肌纤维横截面积及直径，以及肌纤维类型组成占比进行统计分析。结果表明：中国草原红牛不同部位肌纤维直径与横截面积间差异不显著，但不同部位间结缔组织厚度却有明显差异，牛腩部位肌束膜厚度显著高于其他部位，说明牛腩部位肌肉纤维嫩度也较低，西冷部位肌纤维结缔组织厚度低于其他部位，说明西冷肌纤维嫩度较高。大条、米龙和小条部位肌束膜与肌内膜无明显差异。西冷部位Ⅰ型肌纤维占比最大，牛腩部位占比最小，ⅡB型肌纤维占比则是牛腩部位最大，西冷部位占比最小，ⅡA型肌纤维各部位间无明显差异。通过对中国草原红牛不同部位肌纤维组织学特性的分析，为草原红牛的培育和肌肉改良提供参考依据。