对虾原肌球蛋白致敏性消减技术研究进展

王新，张焕兰，邱惠，魏帅*，孙钦秀，夏秋瑜，王泽富，韩宗元，吉宏武,2，刘书成,2*

1(广东海洋大学 食品科技学院,广东省水产品加工与安全重点实验室,广东省海洋生物制品工程实验室,广东省海洋食品工程技术研究中心,水产品深加工广东普通高等学校重点实验室,广东 湛江,524088)2(大连工业大学 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心,辽宁 大连,116034)

随着全民生活水平的提高和食品加工技术的发展，消费者的饮食结构也在发生变化，越来越多可以引发人们过敏的食物被发现。其中能够引发过敏的蛋白或其他活性物质被称为食物过敏原。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)和联合国粮农组织(Food and Agriculture Organization, FAO)发布可引发人类过敏的170多种食物，其中90%的食物过敏由牛奶、鸡蛋、鱼、甲壳类、大豆、小麦、花生、坚果引起，被命名为“The Big-8”[1-2]。流行病学调查显示，近年来食物过敏的发病率在世界范围内不断上升，全球已有3%人口受到过敏带来的影响，已经成为继哮喘病后的全球第二波流行病，严重影响人们的生活质量，已经成为世界公认的食品安全问题之一[3]。

甲壳类动物是FAO和WHO认定为八大类食物过敏原之一，虾及其制品是海鲜过敏的主要原因，主要集中在中国、日本和北美等地区[4]。虾及其制品引发的过敏是由IgE介导的超敏反应，能够引起消费者哮喘、腹泻、皮炎等症状，严重时可引发休克甚至死亡等疾病，严重威胁消费者的健康[5]。

1 原肌球蛋白

虾中含有大量过敏蛋白，目前已经证实的过敏蛋白有：原肌球蛋白(tropomyosin, TM)、精氨酸激酶(arginine kinase, AK)、肌质钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein, SCP)、肌球蛋白轻链(myosin light chain, MLC)、血蓝蛋白亚基(hemocyanin, HC)和肌钙蛋白C(troponin C, TnC)。其中，原肌球蛋白引起的过敏高达80%，是虾中最主要的过敏原[6-7]。

原肌球蛋白是分子质量为32～39 kDa的盐溶性蛋白，理论等电点4.5，含有丰富的谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和丝氨酸，结构以α-螺旋为主，具有热稳定性，在机体中与肌动蛋白和肌球蛋白一起调节肌肉收缩，由HOFFMAN在1981年首次从虾中分离出来，是甲壳类动物主要过敏原[7-9]。不同物种中TM蛋白表现出了高度同源性，结构具有相似性，如：克氏原鳌虾、中国明对虾和凡纳滨对虾等9种虾TM蛋白序列同源性高达90%以上[10]。

近年来，随着检测技术的不断发展，越来越多的过敏原被人们发现，YU等[11]在海螺中分离出99 kDa的新型过敏原，通过质谱法确定为副原肌球蛋白(paramyosin，PM)，并通过生物信息学工具预测出PM蛋白含有7个抗原表位。SUZUKI等[12]在盘鲍中检测到PM蛋白，并且发现PM蛋白与TM蛋白间存在交叉反应。LEE等[13]通过免疫印迹发现煮熟虾的提取物与过敏患者血清在63 kDa处发生结合，通过SDS-PAGE结合质谱技术确定此蛋白为丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)。

2 TM蛋白消减技术

目前，对于食物过敏没有良好的治愈办法，但可以通过有效预防和加工处理降低食物致敏率，一般有2种途径：一是对食品过敏反应进行早期识别和管理、准确标识、提醒和警示过敏人群，如：美国、欧盟、日本等国对含有甲壳类动物的食品标签进行强制标识[14]；二是对含有过敏原的食物进行加工生产低敏甚至脱敏食物[15]。本文针对虾主要过敏原TM蛋白，总结常见的消敏技术。

一些加工技术可以改变虾肉的品质，引起蛋白发生变性、降解、聚合或糖基化等，可能改变了TM蛋白的结构，导致抗原表位的破坏、丢失或者暴露，从而消减TM蛋白致敏性。因此选择合适的加工技术可以有效降低虾的致敏性。TM蛋白是耐热蛋白，传统的热加工很难降低其致敏性，往往需要借助其他手段进行处理以降低其致敏性。目前主要的加工方法有：物理加工法、化学处理法、生物法以及联合处理法。常见的非热加工对TM蛋白致敏性的影响见表1。

表1 常见非热加工方法对TM蛋白致敏性的影响Table 1 Effect of common non-thermal processing technologies on the sensitization of tropomyosin

2.1 物理法

2.1.1 热加工

热加工是传统的食品加工技术，包括蒸、煮、煎、炒、炸等，是以减少食物中微生物、延长保质期和提高品质为目的的一种加工技术。如图1所示，蛋白易受热变性，引起空间结构发生变化，蛋白分子发生伸展，分子间作用力改变，破坏了蛋白的构象表位，降低过敏原免疫结合能力，但热加工不会改变虾TM蛋白线性表位，高温还会引起TM蛋白与还原糖的美拉德反应，可能会增加致敏性[6-7]。热处理不能改变凡纳滨对虾TM蛋白致敏性，煮制后SCP、磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase,TIM)、AK、MLC和TM 5种过敏原IgG结合活性并没有发生改变，高温一定压力处理后MLC活性降低，TIM、AK没有阳性反应，TM蛋白仍然存在较高的IgG结合活性[27]。热处理TM蛋白在经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后仍有较高的致敏性[28]。煮制后的虾与生虾相比，TM蛋白IgE结合活性明显升高[29]。LALY等[30]发现花尾虾在沸水中保持5～25 min后，IgE活性升高18%～27%。但是MEJRHIT等[31]研究摩洛哥人对虾TM蛋白敏感性，发现热处理后，ELISA和Dot Blot显示热处理降低了TM蛋白阳性反应，可能引起摩洛哥人对TM蛋白过敏的抗原表位是构象表位。不同的抗体与TM蛋白之间结合位点不同，高温状态下以α-螺旋为主的TM蛋白空间构象发生改变，但温度恢复到室温后TM蛋白α-螺旋又回复到原始状态[32]，TM蛋白中含有大量的赖氨酸，热加工会促使其与还原糖反应速度加快，形成新的抗原表位，提高了TM蛋白的IgE结合活性。

图1 热加工对过敏原致敏性的影响[7]Fig.1 Effect of allergen reduction by thermal treatment

2.1.2 超高压技术

超高压(high hydrostatic pressure，HHP)技术又叫超高压杀菌技术、高静压技术，是一种非热加工技术，它是在25～60 ℃，通过介质在压强0～1 000 MPa下处理食品[3,7]。HHP主要影响蛋白质之间的氢键、离子键和疏水键等非共价键，破坏蛋白二、三级结构，使蛋白质结构发生不可逆的改变，从而降低了食物致敏性。与热加工相比，HHP处理可保留食品原有的色泽，较大程度保留食物的营养成分，近年来在消减过敏原研究中受到国内外学者广泛关注[3,17]。HHP可以显著降低TM蛋白致敏性，胡志和等[16]发现，虾TM蛋白在300 MPa、20 ℃保压40 min时，致敏性最低[OD492(0.210±0.005)]；而当压强增加至700 MPa时，致敏性最高[OD492(0.328±0.004)]。韩建勋[10]发现HHP未改变TM蛋白一级结构，对二级结构影响较小, 当处理条件为65 ℃、压强为300 MPa保压15 min时致敏性最低，且HHP可破坏TM蛋白表位(MDAIKKKKMQAMKLEKDNAMDRADTLEQQNKEAN-NRA、VAALNRRIQLLEEDLERSEER和QKLQKEVDR-LEDELVNEKEKYKSITDELDQTFSELSGY)。LONG等[17]发现TM蛋白经500 MPa、55 ℃处理10 min后几乎完全失活，而当压强高于500 MPa时，TM蛋白致敏性增大，可能是高压使TM蛋白内部的抗原表位暴露导致的。FAISAL等[18]发现600 MPa、120 ℃处理TM蛋白10 min，其致敏性降低65%，且胃蛋白酶消化后原肌球蛋白抗原性显著降低。

2.1.3 辐照技术

食品辐照作为一种典型的非热食品加工技术，是采用高能、高穿透性射线对食品或原料进行辐照，使食品成分或生物活性物质发生物理变化或化学反应，辐照源包括能量≤10 MeV的电子束、≤ 5 MeV的X射线和Co60和Cs137放射出的γ射线，主要应用于食品杀菌和延长货架期等[33]。辐照可以破坏过敏蛋白的空间构象和表位结构，达到降低或者消除致敏性的作用。采用γ辐射处理虾肉粗提物，TM蛋白含量降低，免疫印迹和ELISA结果显示 TM蛋白IgE活性随着辐照剂量的增加而降低[34]。采用0、1、3、5、7、9 kGy剂量的辐照处理中华管鞭虾TM蛋白，其致敏性降低，在7 kGy时效果最显著，IgG结合能力下降了59%；3、7和9 kGy剂量的电子束辐射导致 α-螺旋和 β-折叠结构含量减少，β-转角结构含量增加，无规则卷曲含量无显著变化[2]。采用γ-辐射处理罗氏沼虾TM蛋白，在10和15 kGy剂量下IgG结合能力明显减少[19]。采用电子束辐照处理冷冻虾TM蛋白，结果显示蛋白发生降解，10 kGy辐照后致敏性降低了20%，而在低剂量3 kGy辐照后致敏性增加了10%，这可能是由于轻微的辐照会产生低浓度的活性氧，改变蛋白的空间结构，反而提高了TM蛋白致敏性[20]。

2.1.4 等离子体技术

等离子体是近年来兴起的一种非热加工技术，又称非热等离子体或低温等离子体，与传统的加工技术相比，有能耗低、处理温度低和耗时短等优点[35]。它是由气体激发和电离后产生物质的一个集合体，包括电子、离子、自由基、负离子等，又被称为“物质第四态”[36]。当过敏蛋白暴露于含有自由基的冷等离子体时，这些活性基团与蛋白质发生相互作用，破坏蛋白质结构，引起α-螺旋和β-折叠含量的变化、酰胺键和侧链的分解，这些变化可能掩盖或破坏构象表位和线性表位，降低过敏性[17,37]。SHRIVER等[38]发现白滨对虾TM蛋白经30 kV、60 Hz处理5 min后致敏性降低了67%。EKEZIE等[21]采用氩气低温等离子体(98%氩气和2%氧气)处理凡纳滨对虾TM蛋白 3、6、9、12、15 min，随着处理时间的延长，间接ELISA显示IgG/IgE分别降低了17.6%和26.87%，巯基含量显著降低，表面疏水性增加，促进了α-螺旋向β-折叠和β-转角的转变。目前，已经发现等离子体可以消减虾、花生、小麦的致敏性，但是有研究证明，等离子体可能会促进油脂的氧化，破坏食品中一些营养成分，降低食品的品质。因此，等离子体在实际加工生产过程中的应用仍有待于进一步确认。

2.1.5 超声技术

超声加工技术有耗能低、无污染和对食品品质影响小等优势，受到人们广泛关注。高强度超声(100～800 W，15 min)处理可减少TM蛋白α-螺旋和β-折叠含量、增加β-转角和无规则卷曲含量，诱导TM蛋白产生多肽片段，ELISA结果显示超声处理后TM蛋白致敏性降低70%，消化率提高[22]。TM蛋白在0、50 ℃下经30 kHz、800 W超声处理1.5 h，0 ℃处理并未明显降低TM蛋白致敏性，50 ℃超声处理后致敏性显著下降，表明超声消减TM蛋白致敏性需要温度共同作用[39]。煮熟的南美白对虾经800 W，30 kHz，0 ℃超声处理30 min后，过敏患者血清与IgE结合能力下降了50%[40]。LI等[41]用30 Hz、800 W超声处理TM蛋白，间接ELISA结果表明，TM蛋白IgE结合活性下降75%，消减率和处理时间成线性关系。室温下20 kHz，400 W超声处理虾制品，0～20 min致敏性随处理时间延长而降低，20 min时TM蛋白含量减少76%，体外消化率提高7.53%[1]。超声处理并不能降低对虾中所有过敏原，CHEN等[42]采用30 ℃，200 W超声处理小龙虾AK蛋白，其致敏性并没有发生明显改变。超声处理是一种非常有潜力的过敏原消减技术，目前关于超声消减TM蛋白致敏性研究相对较少，消减机制还需要进一步研究。

2.1.6 其他物理方法

微波和脉冲强光等物理处理也可以改变TM蛋白致敏性。1 000 W、75～125 ℃微波处理南美白对虾5～15 min，TM蛋白条带强度随着处理温度和时间的增加而降低，125 ℃微波处理15 min后TM蛋白含量减少75%[9]。采用脉冲强光(3 脉冲/s，距光源 10 cm)处理TM蛋白，SDS-PAGE显示4 min后TM蛋白灰度降低，处理1～3 min时，Western bolt显示与未处理TM蛋白相比，IgE结合能力并未发生明显改变，处理4～6 min时，IgE活性显著降低，采用煮沸结合脉冲强光联合处理，TM蛋白致敏性下降程度最大[43]。

2.2 化学法

2.2.1 糖基化

糖基化是还原糖和游离氨基之间发生的非酶促反应，主要发生在经过热处理和长期储存后的食品中。TM蛋白含有丰富的谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和丝氨酸，糖基化可能破坏TM蛋白表位，导致致敏性降低[8,44]。还原糖数量和种类、温度和时间等因素会影响糖基化处理对TM蛋白致敏性的消减效果。美拉德反应(核糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和麦芽糖)可影响青蟹TM蛋白和AK致敏性，半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖降低了TM蛋白的致敏性，只有阿拉伯糖降低了AK致敏性[45]。YUAN等[23]发现经谷氨酰转氨酶催化糖基化后，TM蛋白α-螺旋含量增加、紫外吸收峰发生蓝移、表面疏水性增加、游离氨基含量减少，IgG/IgE结合能力降低。LYU等[44]研究了核糖处理对TM蛋白构象及致敏性影响，发现TM蛋白空间结构发生明显改变，核糖修饰了苯丙氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸残基，改变了TM蛋白抗原表位，4 000 mmol/L核糖可显著降低TM蛋白IgE结合能力，并抑制RBL-2H3细胞释放细胞因子。TM蛋白经低聚乳糖(TM-GOS)、甘露聚糖(TM-MOS)、麦芽五糖(TM-MPS)糖化处理后致敏性降低，而TM-FOS糖化增加了TM蛋白的致敏性和小鼠嗜碱性粒细胞过敏反应，α-螺旋从78.7%分别减少到60.7%(TM-GOS)、66.7%(TM-FOS)、71.3%(TM-MOS)和68.9%(TM-MPS)[46]。

2.2.2 酶处理

酶处理包括：(1)酶解，在胰蛋白酶和木瓜蛋白酶等水解酶作用下，蛋白被水解成多肽、氨基酸以及其他小分子，导致线性表位丢失而降低致敏性；(2)酶交联，常用酶有酪氨酸酶、漆酶、转谷氨酰胺酶和多酚氧化酶，主要是通过分子间交联导致蛋白聚集，引起蛋白空间构象变化而降低致敏性。酶解过程温和，可以有效地破坏蛋白质的功能特性，降低动物过敏原IgE结合能力[7,24,47,48]

AHMED等[24]研究了酪氨酸酶交联对刀额对虾TM蛋白致敏性的影响，发现酪氨酸酶和咖啡酸交联后的TM蛋白分子质量明显变大，灰度值下降，酪氨酸酶处理导致 IgE 结合带在36 kDa处减少；2 000 nkat/g的酪氨酸酶处理导致TM蛋白IgG/IgE结合能力分别下降了33.83%和43.9%。体外和体内实验显示酶交联后提高了TM蛋白消化率，IgG/IgE的识别率显著降低，有效地抑制了细胞脱颗粒[47]。采用漆酶、漆酶/咖啡酸交联TM蛋白，ELISA和WB实验显示IgG/IgE结合活性降低，TM蛋白空间结构发生改变，紫外吸收峰蓝移、荧光最大吸收峰降低且最大吸收波长红移、表面疏水性降低，胃肠消化率提高[8]。通过转谷酰胺酶和酪氨酸酶处理TM蛋白，其蛋白结构发生改变，α-螺旋在转谷酰胺酶和酪氨酸酶处理后分别降低20.1%和15.2%，β-转角分别增加5.8%和6.2%；酪氨酸酶交联后，TM蛋白IgE结合活性下降34.95%[48]，可能是由于TM蛋白表位中含有大量谷氨酸、酪氨酸和赖氨酸，酶处理后导致蛋白表位破坏降低了致敏性。酪氨酸酶和辣根过氧化物酶交联螃蟹TM蛋白，其IgE结合能力分别下降了34.5%和63.5%，IgG结合能力分别降低了16.9%和70.8%，消化稳定性下降，RBL-2H3细胞脱颗粒受到抑制，增加了小鼠口服耐受性[49]。LIU等[50]用胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶处理太平洋白对虾和草虾，发现TM蛋白耐酶解。TM蛋白显示出对胃蛋白酶消化具有一定的抵抗力，而肌球蛋白重链和肌动蛋白都在短时间内迅速降解。酶催化蛋白交联和蛋白水解2种方法可对过敏性蛋白进行修饰，为减轻甲壳动物过敏原的致敏性提供了温和而又安全的方法。

2.2.3 其他化学处理

除了常用的糖基化和酶法可消减TM蛋白的致敏性，还有使用其他化学处理方法，如采用丙烯酰胺、2,2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐、丙二醛、多酚和pH等。25 ℃下将刀额对虾TM蛋白在1 mmol/L丙烯酰胺中孵育24 h，BALB/c 小鼠模型显示TM 蛋白特异性IgE和IgG1血清水平、组胺含量显著降低；RBL-2H3细胞模型显示β-氨基己糖苷酶、组胺、半胱氨酰白三烯和前列腺素D2含量与未处理的TM蛋白相比显著降低(P<0.01)，表明丙烯酰胺可修饰TM蛋白并降低其致敏性，随着处理浓度的增加，TM蛋白IgE结合能力降低[51]。使用2,2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐修饰TM蛋白，羰基和游离氨基含量显著降低，赖氨酸和表面疏水性含量显著增加(P<0.05)；荧光最大发射波长蓝移，荧光强度降低；小鼠模型中TM蛋白特异性IgE/IgG1、组胺和mMCP-1水平显著降低；RBL-2H3细胞中介质释放能力降低；IgG/IgE结合能力显著降低，5和25 mmol/L 2,2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐处理TM蛋白时出现新条带，发生了交联[5]。丙二醛可诱导TM蛋白发生交联，降低α-螺旋含量，增加了β-折叠、β-转角和无规则卷曲含量；表面疏水性和羰基含量显著增加，游离氨基和可用赖氨酸含量显著减少(P<0.05)；低浓度丙二醛交联后的TM蛋白仍有IgG结合活性，而高浓度处理后IgG活性降低，且TM蛋白诱导RBL-2H3释放介质和细胞因子下降[52-53]。虾TM蛋白经不同浓度的丙二醛处理后发生轻微降解，提高了胃蛋白酶消化稳定性，但是TM蛋白IgE结合能力在胃消化后略有下降，肠消化后下降显著[54]。多酚可诱导TM蛋白分子质量发生改变，同时降低TM蛋白的IgG/IgE结合能力，降低RBL-2H3细胞介质释放能力和小鼠模型中TM蛋白的致敏性[4]。pH会影响TM蛋白特异性结合能力，当pH<4.0时，IgG结合能力降低了42.2%[55]，在pH 1.0～3.5下腌制虾肉，TM蛋白IgE结合能力显著降低[56]。

2.3 生物法

发酵是一种传统的加工与保藏技术，发酵法主要利用发酵过程中微生物对一些过敏原蛋白进行分解，引起变性，改变过敏原空间构象，破坏抗原表位，从而达到降低或消除致敏性的目的。发酵法与热处理以及其他物理法相比，不会破坏其他营养物质，还可以分解基质中蛋白质生成肽或氨基酸，促进机体的吸收，一定程度上增加食品风味。目前发酵法在消减水产品致敏性方面的研究较少，现阶段主要应用于豆制品、奶制品以及花生制品的加工中[37,57]。PARK等[58]研究发现发酵过程可以降低虾中TM蛋白与过敏人群血清的结合能力，当发酵温度为25 ℃时，发酵12 d TM蛋白致敏性开始下降，降低发酵温度会延长TM蛋白致敏降低现象的出现时间。FU等[25]发现口服干酪乳杆菌可减轻BALB/c小鼠对虾TM蛋白的过敏症状和肠上皮损伤。虾酱在37 ℃自然发酵过程中， TM蛋白含量和免疫活性随发酵时间的增加而逐渐下降，18 d后致敏性下降69%[59]。

2.4 联合消减

LIU等[26]采用美拉德反应结合热处理TM蛋白，与单独热处理和美拉德反应相比，其消化率有所提高且IgG/IgE结合活性降低更多。采用10 kGy剂量辐照和100 ℃热加工处理TM蛋白，与单独处理相比，消减效果显著提高，但TM蛋白致敏性随着处理时间的延长未发生明显改变[60]。木瓜蛋白酶结合超高压处理虾仁，在酶与底物质量比为1∶130、450 MPa、40 ℃条件下处理55 min，过敏人血清反应OD492(0.053)接近正常人血清OD492(0.05)，单独超高压处理时与过敏人血清结合OD492为0.585，在降低致敏性方面表现出明显的优势[61]。

3 结论

TM蛋白耐酸碱、耐高温、耐消化，传统加工方式不能有效地对其致敏性进行消减。长时间加压高温可以有效地对TM蛋白致敏性进行消减，但会对虾肉品质造成影响。目前，一些非热加工(如：超高压、超声、等离子体、辐照等)在消减对虾TM蛋白致敏性上有了初步研究，但是消减效果不一，也会对虾肉品质带来影响。因此，部分学者采用联合方法进行消减致敏性。虽然两种或多种技术的组合不仅可以提高消减效果，而且可以大大缩短加工时间，保证食品的理化特性，但是与单一技术相比，组合方式需要控制更多的参数，组合技术在连续处理同一对象时，会产生明显的相互作用，可能是协同也可能是拮抗作用，还可能产生不可预见的问题。因此，两种或多种高效联合消减技术的研究仍具有一定的挑战性，有必要寻找更多的可能性，进行更多样化的研究。此外，目前研究对虾过敏原消减技术主要集中在纯化后过敏原的消减，而对于整只虾、虾仁或者虾肉糜的研究较少，是否会有同样的消减作用，仍需进一步的确认和关注。