核酸检测假反应性献血者归队可行性的研究

侯云 周宝琴 杨忠思

采供血机构一直在保证血液安全的前提下大力发展献血者队伍，探讨假反应性献血者归队策略是目前关注的热点问题。采供血机构对酶联免疫吸附试验（简称酶免）呈反应性的献血者归队研究及政策制定已较成熟，但是对核酸检测反应性献血者的归队策略还存在分歧。《反应性献学者屏蔽与归队指南》针对核酸反应性献血者归队策略内容为：（1）2013 版为核酸检测结果必须是无反应性的，献血者可进入归队流程。（2）2015 版调整为核酸三项联检结果反应性而鉴别试验阴性，献血者可进入归队流程。（3）2019 版调整为核酸检测结果必须是无反应性的，即核酸三项联检反应性而鉴别试验阴/ 阳性，献血者都不进入归队流程。因此本文针对核酸归队策略调整的关键点，以综述形式对核酸检测反应性结果不一致情况进行分析，探讨核酸检测假反应性结果存在的可能，为采供血机构采取相应的确证和归队方案提供新的思路。

1 核酸反应性结果初检/再检不一致情况的研究

2015 年核酸检测技术（nucleic acid testing，NAT）在血站全面开展，出现一定数量的酶免阴性核酸反应性的献血者，但是这些献血者的核酸反应性结果重复率偏低，即单人份检测系统联检结果反应性会出现鉴别结果阴性；混样系统初检反应性池（pool），拆分结果为阴性。那么针对这些核酸反应性结果初检/再检不一致的情况，怎样确证标本的真假阳性？该问题是目前采供血机构所面临的共同挑战，亟待解决。

1.1 核酸单人份系统和混样系统判定反应性结果的对比研究

目前核酸检测系统分为单人份系统和混样系统。单人份系统是初检为单个标本在一管内同时检测乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）和 艾滋病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的核酸，当联合检测结果阴性时，则标本直接判定为阴性；而当联合检测有反应性时，则需要进行鉴别试验，进而对该标本分别进行 HBV、HCV 和HIV 单项核酸检测，以明确标本中是哪种病原体核酸阳性。在核酸单人份系统中，常出现联合检测HBV、HCV 和HIV 有反应性而鉴别试验阴性的标本，也称为核酸检测不确定标本。该类标本在核酸单人份系统中占有较高的比例，据深圳市中心血站统计单项NAT 反应性标本的鉴别阳性率为24.76%，即检测不确定标本率高达75.24%[1]。青岛市中心血站2017—2020 年应用基立福核酸检测系统检测不确定标本率为59.14%。核酸单人份系统如此高的不确定标本率，说明有多数的标本是因为鉴别试验阴性联检反应性而判定为不合格。这类标本无法确定究竟是哪种病原体核酸阳性或者是否由实验的假阳性反应引起，其血液直接报废，献血者资格被屏蔽[2]。

混样系统是多个标本混在一个pool 中检测，如果初检混样pool 为反应性时，再进行多个标本的拆分检测，如拆分有反应性标本即判定为该标本反应性；若拆分结果阴性，则所有标本判为阴性。在核酸混样系统中，会出现初检混样pool 为反应性，拆分结果阴性。虽然混样pool 中标本判定结果为阴性，但是无法确定真阴性的可能，会有漏检的风险。青岛市中心血站统计罗氏混样系统上出现46.94%的初检反应性pool，但拆分为阴性的现象，依据现行判定原则是血液合格，可以放行。但有数据显示混检阳性再拆分阴性的标本，感染 HBV 的风险高于合格献血者组成的对照组，说明对混检阳性再拆分阴性的标本中存在的风险要重视[3]。

1.2 核酸反应性结果初检/再检不一致的原因

核酸单人份系统和混样系统，在初始检测和再次检测实验中，一致的标本实验者直接判定为NAT 反应性，血液报废，献血者永久屏蔽。而对于初始检测反应性，再次检测，无论鉴别实验还是拆分实验非反应性的，需要实验者进行确证，其原因多为以下几方面。

（1）隐匿性乙型肝炎病毒感染（occult HBV infection，OBI）的存在。OBI 是血液中乙肝表面抗原阴性而NAT 检测阳性的HBV 感染特殊类型，当病毒浓度极低时（病毒颗粒在血浆中分布不均匀），可以完全检出的概率较低，因此进行NAT 检测时，相较于窗口期标本，隐匿性感染标本可能更容易漏检。随着NAT 的普及，越来越多的OBI 被检出，国内许多地区献血者都有较高的OBI 感染率，感染率接近1‰或更高[4-5]。广东地区献血者OBI 阳性率可达1.5‰[6]，因此每年淘汰的献血者达上百人。青岛市中心血站将部分基立福初检反应性标本送临检中心进行 HBV 定量检测， 联检反应性鉴别阴性的标本中18.5%可以被定量系统检测出HBV 核酸的存在。因此核酸初检/再检不一致检测结果可能是标本中存在低浓度的病毒。

（2）献血时的NAT 检测为假阳性。这种情况在核酸单人份系统较为多见。该系统只要初检有反应性即判为不合格，往往假阳性较高，假阳性率可达21.6%[7]。广州市中心血站对随机抽选的391 例核酸反应性献血者标本进行二次检测，76.99%标本为非反应性；非反应性标本在罗氏进行再次确认，98.34%标本仍为阴性；由此推断这部分标本在首次 NAT 联检时可能出现假反应。大连核酸检测假阳性率占初次反应性标本 50.3%[8]。基立福系统数据表明酶免阴性核酸联检反应性的标本有24%～28%的假反应性标本。

2 核酸假反应性献血者确证和归队方案的研究

2.1 核酸单人份检测系统不确定标本的确证研究

（1）首选对该类标本可以进行2 次联检和1 次鉴别的实验流程，≥1 次反应性结果判定为不合格。该流程操作简单，可行性高，只需注意留取足量的标本。

（2）应用超高速离心技术，同时与靶向病毒基因区段符合的高敏感度巢式PCR 检测相结合，对标本进行病毒核酸的确认。该方案技术复杂，要求配套设备多，多数需要公司配合完成。大连市血液中心应用两流程对该类标本进行确认，并比较2 个流程的优劣，超离体系的 HBV 确认能力明显好于推荐流程[9]。（3）实验者可对该类献血者进行追踪，至少追踪2 次，间隔6 个月，通过不同的核酸检测系统进行确证，≥1 次反应性结果都判定为不合格；同时补充乙肝核心抗体（抗-HBc）或乙肝“2 对半”检测，如抗-HBc 阳性，则可以初步判断为OBI。安徽省血液中心完成28 名酶免阴性核酸阳性献血者的2 次追踪，所有随访标本分别在献血后3 个月在浩源、基立福或罗氏系统在核酸检测系统进行单人份核酸检测，发现献血者NAT 仍呈反应性的占75%，可以归队的献血者只有1 例（占3.57%）[10]。虽然归队比例远低于酶免单试剂反应性归队比例[11]，但是同时也说明核酸反应性献血者存在假阳性的可能，且是核酸单人份系统的不确定标本。

2.2 核酸混样系统初检/再检不一致标本确证研究。

（1）对于初次拆分非反应性的标本再进行2 次拆分后进行结果的判定，≥1 次反应性结果即判为不合格，非反应性结果则合格，这样可以避免1 次拆分假阴性的漏检。成都血液中心报道约在20 000 份标本中出现1 例混检反应性初次拆分阴性，通过2 次拆分确认的 HBV DNA 反应性标本[12]。临检中心中也建议对初次拆分非反应性的标本进行2 次拆分后再予以放行的改进型策略[13]。

（2）对于初次拆分无反应性的标本，可以应用单人份系统对其进行联检判定，若为反应性结果再进行鉴别试验；≥1 次反应性结果即判为不合格，非反应性结果则合格。青岛市中心血站[14]抽取2019 年拆分检测非反应性标本120份（20 个混样pool），通过冻存留样后进行联合检测全部为阴性；而2021 年抽取60 份（10 个混样pool），混检后平行进行基立福检测，有2 个混样pool 出现反应性标本。推测采血管中标本的储存条件以及病毒载量低，是导致检测结果重复性不佳的另一原因，确证检测时需要重视和规避这些问题。

2.3 核酸假反应性献血者归队方案的研究

由于不同国家或地区的输血相关病毒流行率不同，采供血机构在保证血液安全的同时，采取不同的检测策略和应对措施，以最大程度地减少对假反应性献血者的屏蔽和淘汰。美国地区针对单人份检测模式的NAT 反应性血液标本，无论该标本是重复反应性还是非重复反应性，都判定为不合格[15]。对于初次NAT 重复检测结果不一致的献血者，6 个月后再次进行 NAT 和酶免检测，如果再检结果均为阴性则该类献血者可以归队。而澳大利亚等输血相关病毒流行率较低的国家，采取的检测策略是初次NAT 反应性标本再次复检2 次，同时根据血清学（抗体等）试验结果进行判断；对于复检阴性、血清学阴性的标本判定为合格，其血液运行放行，献血者可以归队[16]。

中国属于病毒性肝炎高发地区，实验室检测数据显示60%的人口既往接触过HBV， 其中HBV 慢性携带者占比约为7.2%[17]；而无偿献血人群中OBI 的流行率约为0.04%，明显高于低HBV 流行率地区[18-19]。目前国内采供血机构对于单人份检测系统只要初次联检反应性结果即予以报废，献血者屏蔽。该策略以最大程度降低输血相关感染的风险，但却忽略了假阳性的存在，损失了部分献血者的权益；对于混样系统反应性pool 中拆分1 次阴性即放行的策略，虽然符合试剂判定规则，却低估了可能的漏检风险。国内采供血机构可在保证临床供血安全的前提下，对于血液的处置判定依据初筛检测结果，但对于献血者资格判定应考虑后续补充检测的结果：（1）首选标本重复检测（自身系统或是其他核酸系统），建议进行2 ～3 次的重复（最好取自血浆袋的标本）。（2）补充抗-HBc 或乙肝“2 对半”检测，如抗-HBc 阳性则可以初步判断为OBI。（3）对献血者进行随访检测，建议至少随访2 次以上，间隔3 个月。（4）补充血清学试验和核酸定量分析，确定是窗口期感染、隐匿性感染、慢性感染、感染恢复期或假阳性，这样可以给予献血者较明确的结果解释。

综上所述，NAT 在血筛的应用能最大程度地降低输血相关病毒感染的风险，但同时也增加了献血人群阳性率的检出。就意味着在国内无偿献血人群中有更多的人检测结果异常，不适合献血。对于这部分人，尤其是固定献血的人群，他们除了接受这样的结果以外，更有必要得到准确合理的解答。这就要求采供血机构对核酸检测结果的真伪进行进一步的确证，在合适的条件下允许假反应性献血者归队，避免血源的浪费。同时对于反应性的献血者给予正确的指导建议，提高献血者的回访满意度。另外，更重要的是将低水平病毒感染构成的潜在输血风险降到最低，这也是采供血机构无偿献血事业自始而终的责任和义务。