沉默miR-331-5p对帕金森病模型大鼠的干预效果及作用机制

才昊 栾梅 赵德福 (锦州医科大学附属第三医院 神经内科，辽宁 锦州 000；老年科)

帕金森病是我国常见的老年病之一，是一种临床较为常见的神经系统退行性病变〔1,2〕。帕金森病高发人群为老年及体弱群体〔3〕。帕金森病患者一旦患病，常会表现出运动障碍、四肢失控等症状，对于患者的日常生活及家庭压力均造成严重的影响〔4,5〕。但现如今对于其发病机制还未研究透彻，一些针对性的治疗也未能达到理想效果。微小RNA(miRNA)在帕金森病发生发展过程中极为重要〔6〕，本研究探讨沉默miR-331-5p对帕金森病大鼠的干预效果及相关作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 选取40只SD健康雄性大鼠，由江苏艾菱菲生物科技提供，8～10月龄，平均(8.9±0.8)个月；体重231～245 g，平均体重(238.2±4.9)g。在相对湿度50%～55%、温度(23.2±2.3)℃的环境中喂养1 w，光照12 h/d。

主要试剂：兔抗小鼠miR-331-5p抗体(Dako公司)；大鼠抗小鼠苏氨酸蛋白磷酸酶(PHLPP)1抗体(Hyclone公司)；小鼠抗大鼠白细胞介素(IL)-3、肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体(Selleck公司)；兔抗大鼠过氧化氢酶(CAT)、终末氧化蛋白(AOPP)抗体(BD公司)；小鼠抗兔因子重组人自噬效应蛋白(Beclin)-1、微管相关蛋白轻链(LC)3-Ⅱ抗体(Invitrogen公司)；大鼠抗小鼠磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抗体(Sigma公司)；小鼠抗兔雷帕霉素机械靶蛋白(mTOR)抗体(Gibco公司)。

1.2建模及分组干预 随机选取10只大鼠为正常组，不做处理。剩余30只建立帕金森病模型：将鱼藤酮在葵花油乳油中溶解，浓度2 mg/ml，之后对大鼠进行颈背部皮下注射，剂量2 mg/(kg·d)，1次/d，连续注射28 d。对大鼠行为学进行观察检测，大鼠肢体僵直、震颤、步态不稳、行动迟缓可视为建模成功，共建模成功25只。将25只帕金森病模型大鼠随机分为模型组9只及上调组、沉默组各8只，上调组尾部静脉注射30 mg/kg agomiR-331-5p，沉默组尾部静脉注射30 mg/kg antagomiR-331-5p，正常组、模型组尾部静脉注射等量生理盐水。

1.3指标监测 (1)学习记忆能力检测：参考李岩〔7〕的研究开设水迷宫实验检测各组大鼠学习记忆能力。记录各组大鼠逃避潜伏期时间及穿越平台次数。(2)标本制备、苏木素-伊红(HE)染色：各组大鼠麻醉后行断头法处死，取其脑组织，于4%甲醛中浸泡固定24 h后，常规石蜡包埋后行连续切片，进行HE染色，封片后，通过高倍显微镜对其进行观察，对神经元大小进行统计。(3)miR-331-5p表达检测：RT-PCR检测miR-331-5p表达，内参U6。(4)炎症反应、氧化应激反应指标检测：酶联免疫吸附实验法检测IL-3、TNF-α、CAT、AOPP水平，详细检测步骤见说明书。(5)PHLPP1及自噬、凋亡蛋白表达检测：使用Western印迹检测PHLPP1及自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ、凋亡蛋白PI3K、mTOR相对表达量。

1.4统计学处理 采用SPSS26.0软件进行F检验、t检验。

2 结 果

2.1各组脑组织病理学观察 正常组脑组织细胞较为平整，细胞排列较为规则；模型组及上调组脑组织细胞存在大量破裂、肿胀等异常表现，细胞排列紊乱；沉默组细胞存在些许破裂、肿胀表现，细胞排列较为规律。见图1。

图1 各组脑组织病理学观察(HE染色，×400)

2.2各组miR-331-5p、PHLPP1表达对比 模型组、上调组、沉默组miR-331-5p、PHLPP1表达明显高于正常组(P<0.05)；且沉默组miR-331-5p、PHLPP1表达明显低于模型组、上调组(P<0.05)。见表1。

2.3各组学习记忆能力变化情况 模型组、上调组、沉默组第1、3、5天时逃避潜伏期均明显长于正常组，穿越平台次数均明显少于正常组(P<0.05)；且沉默组第1、3、5天时逃避潜伏期均明显短于模型组、上调组，穿越平台次数均明显多于模型组、上调组(P<0.05)。见表1。

表1 各组miR-331-5p、PHLPP1表达、学习记忆能力

2.4各组两侧神经元大小比较 模型组、上调组、沉默组左侧及右侧神经元均明显小于正常组(P<0.05)；且沉默组左侧及右侧神经元均明显大于模型组与上调组(P<0.05)。见表2。

表2 各组两侧神经元大小比较

2.5各组炎症反应、氧化应激反应比较 模型组、上调组、沉默组CAT水平明显低于正常组，IL-3、TNF-α、AOPP水平明显高于正常组(P<0.05)；且沉默组CAT水平明显高于模型组与上调组，IL-3、TNF-α、AOPP水平明显低于模型组与上调组(P<0.05)。见表3。

2.6各组自噬、凋亡蛋白相对表达比较 模型组、上调组、沉默组Beclin-1、LC3-Ⅱ表达量明显高于正常组，PI3K、mTOR相对表达量明显低于正常组(均P<0.05)；沉默组Beclin-1、LC3-Ⅱ相对表达量明显低于模型组与上调组，PI3K、mTOR相对表达量明显高于模型组与上调组(P<0.05)。见表3、图2。

表3 各组炎症反应、氧化应激反应、自噬、凋亡蛋白相对表达量比较

图2 Western印迹检测自噬、凋亡蛋白表达

3 讨 论

帕金森病属于神经科疾病，且主要发病于老年弱势群体中，年龄因素、环境因素、家庭遗传因素等均为帕金森病症状发病危险因素〔8，9〕。帕金森病患者一般病症主要表现为运动及精神的障碍，会对患者的健康及生活均造成严重的影响〔10，11〕。至今为止尚无一种特效的治疗帕金森病的手段，且关于其发病机制临床也未研究清晰，基于此，对于其发病的机制研究为重中之重〔12,13〕。

miRNA与炎症反应、微生物感染、免疫系统变化等生物学行为密切相关〔14,15〕。miR-331-5p为miRNA家族的重要组成部分，有研究表示，miR-331-5p在帕金森病中呈现异常高表达，且其表达变化与帕金森病症状严重程度具有密切联系〔16〕。PHLPP1具有高度保守性，其表达变化参与细胞增殖、凋亡、黏附等多种生物学过程。本研究结果显示，miR-331-5p、PHLPP1在帕金森病大鼠中呈现异常高表达，沉默miR-331-5p表达的帕金森病大鼠PHLPP1也随之下降，分析其原因为沉默miR-331-5p能够通过调控PHLPP1表达来抑制帕金森病大鼠脑组织细胞凋亡，起到神经保护作用。

大量实验研究表示，帕金森病的发生发展对机体神经功能、认知功能造成严重损伤〔17〕。余恒等〔18〕在研究中通过水迷宫实验对帕金森病模型大鼠神经功能、认知功能变化情况，表明正确且有效的干预方法能够更好保护神经系统，从而显著提升大鼠的学习记忆能力。本研究结果说明帕金森病模型大鼠神经功能受到一定损伤，沉默miR-331-5p表达能够起到一定神经损伤保护作用，从而提升大鼠学习记忆能力。

机体炎症状态及氧化应激反应与帕金森病发生发展息息相关〔19,20〕。IL-3、TNF-α、CAT、AOPP即为临床上常用于评价机体炎症反应及氧化应激状态的指标。本研究结果说明沉默miR-331-5p表达能够调控IL-3、TNF-α、CAT、AOPP水平，能够有效改善大鼠体内的炎症及氧化应激状态。

帕金森病发生发展伴随着脑组织神经细胞自噬、凋亡〔21,22〕。Beclin-1、LC3-Ⅱ、P13K、mTOR反映帕金森病患者的细胞自噬及凋亡状况。本文研究结果显示，沉默miR-331-5p表达的帕金森病大鼠Beclin-1、LC3-Ⅱ、P13K、mTOR受到明显调控，说明沉默miR-331-5p能够有效抑制大鼠神经细胞的自噬及凋亡，有效缓解大鼠的神经损伤情况。

综上，沉默帕金森病大鼠miR-331-5p表达，对于大鼠的神经元具有较好的改善效果，从而提升学习及记忆能力，缓解大鼠体内炎症及氧化应激状态，对脑组织细胞的自噬、凋亡，从而起到神经元保护作用。