细胞衰老分子机制的研究进展

王学 任丽君 张英为 周玉皆 (南京大学医学院附属鼓楼医院，江苏 南京 210008)

细胞衰老现象最早在1961年被报道〔1〕，美国生物学家Leonard Hayflick 在体外培养正常人的成纤维细胞时发现，即使细胞在最适宜的条件，细胞分裂至一定代数时也会发生停滞，由此细胞周期进入了一种“不可逆”的停滞状态。Hayflick 基于这种现象提出了细胞衰老的概念。因此，细胞增殖的能力极限也被称为 Hayflick 极限。研究表明〔2〕，这种现象是随着复制次数的增多，染色体两端端粒的逐步缩短伴随端粒酶活性降低所致。后来，随着研究的深入，研究人员发现许多因素均可导致细胞衰老，常见的包括活性氧自由基的产生、癌基因的激活或抑癌基因的失活、辐射及各种细胞因子和细胞信号转导等。本文就细胞衰老分子机制的研究进展进行综述。

1 细胞衰老

根据发生机制的不同，细胞衰老可分为两大类，第一种由生理性原因引起的细胞衰老，称之为复制性衰老。第二种是指细胞在达到 Hayflick极限之前，细胞就开始了衰老过程，被称之为过早性衰老。衰老细胞可表现出一系列类似且特异性的特点，这些特点可以作为判断细胞衰老的标准。这些特征包括：①细胞长久地处于细胞周期阻滞或永久退出细胞周期，增殖标志(如Ki67)缺失;②形态上，衰老细胞通常变得扁平，胞体和胞核的体积变大;③衰老细胞的细胞质内颗粒增加，即形成衰老相关异染色质集落(SAHF)。在衰老细胞内，SAHF主要表现为染色质凝集，DNA凝结成散在、致密、大小不均一的异染色质颗粒;④端粒缩短;⑤衰老相关分泌表型(SASP)：衰老细胞可以分泌多种细胞因子，如胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF)-β、白介素(IL)、Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)-1等，这些因子通过自分泌或旁分泌的方式作用于衰老细胞本身或周围其他细胞，从而改变衰老细胞及其周围的微环境;⑥表达肿瘤抑制因子P16，P21，P53等;⑦表达衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)， SA-β-gal是一种催化β-半乳糖苷水解为单糖的水解酶，在衰老细胞中过度积累和表达。

2 细胞衰老的机制

2.1端粒参与细胞衰老的发生机制 端粒是由DNA(5'-TTAGGG-3')重复序列和6种特异性蛋白质组成的环构象的特殊结构，位于染色体两端，其功能是保护染色体的末端免受DNA修复过程的侵蚀或融合〔2〕。细胞分裂周期中端粒逐渐缩短，当缩短至Hayflick 极限时，端粒末端暴露、染色体触发经典的DNA损伤修复(DDR)反应，细胞周期进入衰老停滞状态〔3〕。且随着年龄的增长端粒缩短和衰老细胞的数量均会增加〔4〕。端粒酶是合成端粒DNA的核糖核蛋白，由端粒酶逆转录酶(TERT)和非编码RNA端粒酶(TERC)组成，负责维持端粒长度，还可影响线粒体功能〔5〕。CCHC域含多克隆抗体(ZCCHC)8是脊椎动物的一种含锌关节蛋白，调节端粒酶3'末端成熟。TERT、TERC或ZCCHC8的杂合突变均可表现为经典的短端粒综合征，从而导致细胞进入衰老状态〔6〕。

2.2抑癌基因参与的细胞衰老发生机制 磷酸酶基因(PTEN)位于十号染色体，为一种抑癌基因，具有磷酸酯酶的活性。在各种细胞中通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/ 蛋白激酶B(AKT)途径来调节细胞的生长、增殖、凋亡和黏附。核转录因子(NF)-κB是PI3K/AKT信号通路的重要靶标，且NF-κB信号传导途径可促进SASP的出现。体外实验表明，用博来霉素处理肺泡上皮细胞(AEC)观察到AEC出现细胞衰老的同时PTEN基因表达也降低。进一步研究发现，敲除PTEN基因可加速AEC衰老，而敲低NF-κB的表达或通过药理抑制NF-κB信号可逆转AEC衰老。在肺纤维化动物模型中，上调PTEN基因表达可延长小鼠的寿命，其下调可加速小鼠衰老。这些结果表明，PTEN基因经由NF-κB信号通路负性调控细胞衰老，PTEN基因下调/缺失与肺泡上皮细胞衰老相关〔7〕。

2.3线粒体参与的细胞衰老发生机制 线粒体是负责产能的双膜细胞器，其完整性是通过生物合成和吞噬等多个过程协调维持，统称为线粒体质量控制(MQC)。MQC失调和炎症发生是细胞衰老和衰老相关性疾病的主要特征之一，称为线粒体功能障碍〔8〕。众多学者认为线粒体功能障碍导致细胞内线粒体活性氧(ROS)持续增加，使得线粒体DNA突变积累，氧化磷酸化、抗氧化防御能力受损加重DDR，导致细胞衰老的发生〔9〕。

此外，研究发现在衰老的AEC中雷帕霉素/过氧化物酶体增殖物激活的受体-γ复合物1α/β(mTOR/PGC-1α/β)轴明显上调。在肺纤维化小鼠模型中发现，随着该轴的激活细胞中线粒体数目、氧化磷酸化过程、ROS产量均增加。抑制mTOR复合物1的功能不仅恢复了线粒体的稳态，同时也降低了AEC的衰老。Summer等〔10〕将线粒体特异性超氧化物清除剂MitoTempo处理暴露于博莱霉素后的细胞发现mTOR /PGC-1α/β轴的活性、线粒体耗氧量、细胞衰老标志物的表达均显著降低。由此推测，mTOR /PGC-1α/β轴在线粒体参与细胞衰老的过程中起到了重要的参与和调控作用。

2.4辐射参与的细胞衰老发生机制 放射治疗是现在多种肿瘤的基本治疗手段，放疗产生的电离辐射(IR)却是细胞衰老的强力诱导剂。一方面，IR会导致肿瘤细胞DNA受损，抑制肿瘤细胞的增殖，激活肿瘤免疫监视；另一方面，IR可诱导周围正常细胞衰老，导致正常组织纤维化和器官功能障碍〔11〕。同时IR刺激免疫系统迅速消除这些衰老细胞。如果衰老细胞产量超过免疫系统清除能力或免疫系统受损而无法有效清除这些衰老细胞，则衰老细胞会积累。Palacio等〔12〕发现将小鼠暴露于IR后脾脏T细胞的增殖反应降低，脾细胞种群中SASP和p16的表达增加。通过消除p16阳性细胞的小鼠发现受损的T细胞增殖会部分逆转。此外，从受辐射的脾脏中分离出的巨噬细胞在体外吞噬活性也降低，该活性也通过消除p16表达而得以恢复。这表明IR所导致的衰老细胞被清除后，免疫细胞功能可得到一定的恢复。

2.5其他因素参与的细胞衰老发生机制

2.5.1DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)参与的细胞衰老发生机制 DNA-PK是PI3K相关酶家族的成员，由DNA-PK催化亚基(DNA-PKcs)和Ku80、Ku70亚基组成的Ku异二聚体，是DNA损伤反应的主要调控因子，在DNA双链断裂修复和有丝分裂中起作用〔13〕。最近的证据表明，DNA-PK活性随年龄增长而增加，从而促进线粒体丢失和体重增加〔14〕。 Liu等〔15〕研究发现从正常衰老个体分离的成纤维细胞DNA中DNA-PKcs、Ku70、Ku80的表达水平均降低，且抑制DNA-PKcs的表达可使原代血管平滑肌细胞的增殖降低，研究结果显示DNA-PK表达降低可导致细胞增殖能力下降。Habiel等〔16〕用DNA-PKCs抑制剂Nu7441处理肺成纤维细胞，通过流式细胞仪分析发现，与未处理的细胞相比，经Nu7441处理的肺成纤维细胞在形态上变得扁平，体积变大。同时对经Nu7441处理的肺成纤维细胞进行RNA分析，发现与衰老相关的转录本也增加。因此作者推测DNA-PKCs也参与了肺成纤维细胞的衰老。DNA-PK参与细胞衰老发生的可能原因有二。其一，DNA-PK可维持端粒的功能，Ku亚单位可与端粒结合，缺乏Ku70、Ku80或DNA-PKcs的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)具有更高数量的端粒融合〔17〕。其二，端粒长度的调控是由端粒和端粒酶共同控制。人类细胞系HCT116中DNA-PK的失活缩短了端粒，表明DNA-PK在端粒长度维持中也起一定作用〔18〕。为了确定DNA-PKCs在端粒长度控制中的作用是否依赖于端粒酶，Espejel等〔19〕将DNA-PKCs和端粒酶双重缺陷的小鼠与单纯端粒酶缺陷的小鼠相比，发现DNA-PKCs和端粒酶双重缺陷的小鼠端粒缩短的速度更快、程度更重，研究结果表明DNA-PKCs在端粒长度的调控中是依赖于端粒酶的。

2.5.2IL参与的细胞衰老发生机制 IL-18属于IL-1 基因家族，是一种促炎性细胞因子，在机体免疫中起作用〔20〕。用IL-18处理肺成纤维细胞72 h后发现表达β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)阳性细胞显著增加，且进入G1期细胞比例大幅上升，同时在成纤维细胞中P21、P53和P27的表达也急剧增加。P27蛋白介导细胞G1期阻滞、减缓或阻止细胞分裂。这些结果表明IL-18触发肺成纤维细胞的衰老。Klotho是一种新型的抗衰老基因，编码具有多个多效作用的单程跨膜蛋白；降低Klotho的蛋白水平或活性可导致年龄性相关疾病的发生甚至降低寿命〔21〕。Zhang等〔22〕发现IL-18处理肺成纤维细胞72 h后，细胞中Klotho的表达降低；上调Klotho表达水平可减弱IL-18诱导的上述细胞衰老效应，抑制SASP产生。综上，这些研究提示IL-18可能通过下调Klotho表达促进成纤维细胞衰老。

2.5.3纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)-1参与的细胞衰老发生机制 PAI-1是组织型和尿激酶型纤溶酶原激活物的主要抑制剂，可将纤溶酶原转化为纤溶酶促进纤维蛋白溶解〔23〕。多项实验发现〔24，25〕，衰老细胞中PAI-1的表达增加。证据表明〔26〕PAI-1不仅是细胞衰老的标志物，更是细胞衰老的媒介。当细胞处于非分裂状态时，细胞内的视网膜母细胞瘤(Rb)抑癌基因处于非磷酸化的状态，非磷酸化的Rb和转录因子E2F结合，从而绑定E2F、抑制E2F转录活性使细胞周期发生停滞。PAI-1可以诱导P53的活性，激活后的P53可入核诱导P21表达，其调控下游细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子(CDKN1A)基因的转录表达。细胞周期素依赖性蛋白激酶(CDK)和细胞周期蛋白(cyclin)是细胞周期调控中起重要作用的两类蛋白，CDK/cyclin 复合物促使非磷酸化Rb和E2F分离调控细胞进入细胞增殖周期。CDKN1A的表达抑制了 CDK/cyclin 复合物活性，使得磷酸化Rb蛋白转变为非磷酸化Rb蛋白从而绑定E2F(P53-P21-PRb细胞周期途径)，细胞发生周期阻滞，启动细胞衰老进程。

2.5.4microRNA(miRNA)参与的细胞衰老发生机制 miRNA是非编码RNA，可在转录后水平调节基因表达，在多种病理中起着重要的作用。研究报道miRNA介导细胞衰老过程〔27〕。P53可诱导miR-34家族miRNA的表达，其已被确定为P53调控细胞周期的下游介质，上调miR-34可导致参与细胞周期的关键靶基因包括E2F1、c-Myc和周期蛋白(CCN)E2的表达下调。miR-34表达上调直接抑制c-Myc及其下游P16基因的表达，P16下游CDK/cyclin 复合物活性降低阻止非磷酸化Rb和E2F分离，细胞周期进入阻滞；miR-34上调可直接抑制E2F基因表达，阻止细胞增殖。miRNA通过参与P16-PRb细胞周期增殖途径，抑制周期中各种靶基因的表达，在转录后水平调节细胞衰老〔28〕。

DNA质量控制和蛋白质质量控制对维持动物生理的年轻化至关重要。因此，DNA质量控制和蛋白质质量控制机制被认为是细胞衰老和衰老的关键靶点。然而，这两种质量控制机制的性能都受到线粒体和胞质中产生的ROS影响〔29〕。已知miRNAs可导致ROS的产生，据报道〔30〕miR-24通过直接靶向DNA拓扑异构酶(TOP)Ⅰ来加剧ROS的产生，破坏DNA质量控制和蛋白质质量控制诱导细胞衰老的发生。Yu等〔31〕发现miR-141在复制型和组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACI)诱导的人骨髓间充质干细胞衰老中的过度表达，ZMPSTE24人源重组蛋白(Q01)是其直接靶标，它参与了层黏连蛋白A的翻译后成熟，并导致与细胞衰老相关的重组核纤层蛋白前体A的积累，促使细胞进入衰老停滞阶段。

2.5.5Wnt信号通路参与的细胞衰老发生机制 Wnt信号通路控制细胞的迁移、增殖、分化等过程，配体是分泌糖蛋白，可通过作用于各种跨膜受体来激活β-catenin依赖性经典或非经典WNT途径〔32〕。缺乏Wnt2/2B或β-catenin的小鼠无法形成肺这一事实说明了Wnt信号对于肺发育的重要性。迄今为止，有关Wnt信号和肺衰老的报道很少。但Lehmann等〔33〕探索了衰老小鼠肺中Wnt相关转录本的差异表达，发现经典的Wnt信号随着年龄的增长而减少，而在老年肺中非经典Wnt5A的表达增加，并且在老化的造血干细胞(HSC)中Wnt5A的表达也增加。此外，与3个月大的小鼠相比，在12个月大的小鼠肺中Wnt2和β-catenin基因表达被下调。因此，科学家认为肺衰老一定程度上是由Wnt信号通路的异常活动所驱动，这个过程也被叫做拮抗多效性或发育漂移。有研究显示，秀丽隐杆线虫中不同Wnt配体的敲除或突变可影响蠕虫寿命，表明Wnt微环境的变化也可直接影响衰老〔33〕。

2.5.6TGF-β TGF-β是一种多效性细胞因子，可调节多种细胞过程〔34〕。证据表明〔35〕，TGF-β信号传导与衰老相关疾病之间存在多方面的关联。TGF-β信号转导受损或表达上调均可导致细胞变性、组织纤维化、再生能力降低、代谢功能异常。TGF-β与细胞表面的配体结合后通过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶激活诱导Smad2和Smad3蛋白磷酸化，形成特异性R-Smads，激活的R-Smads与共同伙伴Smad4形成复合体，该复合物易位至细胞核并通过以下几种方式参与细胞衰老的过程：①TGF-β上调P15、P21、P27等蛋白的表达及抑制增殖基因c-Myc的转录使得细胞进入衰老周期；②TGF-β诱导细胞线粒体产生ROS，触发经典的DDR反应，细胞进入衰老停滞状态；③TGF-β下调细胞中TERT的表达来抑制端粒酶活性，引起端粒缩短，细胞随即进入衰老周期；④TGF-β使PAI-1的活性、细胞外基质(ECM)的表达均增加，且PAI-1和ECM均可使SASP表达增加，SASP以自分泌或旁分泌方式诱导和维持细胞衰老表型。

综上，细胞衰老无时无刻不在机体发生，其既有积极一面，也有消极一面。复制性衰老可保护机体的新陈代谢，阻止受损及衰老细胞的继续增殖。过早性衰老参与机体许多病理过程，与衰老相关疾病的发生密不可分，比如癌症和纤维化。本文总结了参与细胞衰老发生的不同机制，为细胞衰老的发生过程及抗衰老靶向药物的研究提供了依据。