正交试验优化神香草中的迷迭香酸和蒙花苷提取工艺

韩雪，李莉，刘佳倪，刁娟娟

神香草为唇形科（Labiatae）神香草属（Hyssopus L.）硬尖神香草，嫩芽可以用来制茶，其茶具有帮助脂肪分解、消化的功效，叶也常常被用于烹调食物［1］。神香草挥发油中主要含有莰烯、蒎烯、蒎莰酮等成分［2-6］，被广泛应用于化妆品、化工及食品香料等行业。此外神香草应用最普遍的是其药用价值，是维吾尔民间常用中药材，也是寒喘祖帕颗粒和罗欧咳祖帕的主要成分之一，野生神香草主要生长在新疆的阿勒泰等地，收载于《中国植物志》［7］、中华人民共和国卫生部药品标准等，主治功能为化痰、止咳、祛风寒、杀菌，用于治疗咳嗽、头疼、哮喘及寒性引起的感冒［8-9］。部颁标准中只记载神香草的形状等特征，对其鉴别检查、含量测定均无明确规定。相关文献报道，神香草中含有丰富的化学成分，主要包括挥发油、萜类、黄酮、酚酸、多糖等［10-14］，其中酚酸类成分迷迭香酸具有杀菌、抗炎、调节免疫及抗衰老的功效［15-16］。蒙花苷属于黄酮类化合物，可以抗菌消炎［17-18］、并对慢性气管炎有一定疗效。前期课题组证实迷迭香酸和蒙花苷抗炎平喘的作用，同时又可以与市场中常出现的混淆品大苞荆芥加以区分，因此将迷迭香酸和蒙花苷作为本次实验的指标成分。正交试验设计是分式析因设计的方法之一，在研究多因素多水平的同时是寻求二者较优组合的一种简单、高效、迅速的方法［19］。

本研究自2021年3—5月结合单因素试验的结果，采用L9（34）正交试验优化神香草中迷迭香酸和蒙花苷的提取工艺，并采用高效液相色谱法测定神香草中的主要成分迷迭香酸及蒙花苷的含量，为后续研究提供最优工艺条件，对其质量控制提供前期基础。

1 仪器与药材试剂

1.1 仪器数控超声波清洗器（KQ500DE，昆山市超声仪器有限公司），电子天平（AL-104，梅特勒-托利多仪器有限公司），分析天平（AB135-S，d=0.01/0.1 mg，Mettler-TeLedo），高效液相色谱仪（日本岛津，LC-2AT），色谱柱（Sepax HPLC18，4.6 mm×250 mm 5 μm）。

1.2 药材与试剂磷酸、乙腈均为色谱级；甲醇为分析级；迷迭香酸（批号111871-201706，中国食品药品研究院），纯度＞98%；蒙花苷（批号20210606，北京索莱宝科技有限公司），纯度＞98%。

本次实验用的神香草药材产地主要为新疆各地区、州，由新疆医科大学药学院帕丽达教授鉴定，为正品硬尖神香草（Hyssopus officinalis）。

2 溶液的制备

2.1 对照品混合溶液的制备取迷迭香酸、蒙花苷对照品适量，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1毫升各含10 μg的混合溶液，即得。

2.2 供试品溶液的制备取神香草粉末，精密称定0.5 g，于具塞锥形瓶中，精密吸取60%甲醇10 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）20 min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3 色谱方法的建立

色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸，按乙腈（A）∶0.1%磷酸（B）为（25∶75）等度洗脱；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；进样体积为10 μL；检测波长为330 nm。理论塔板数按迷迭香酸和蒙花苷计算均不得低于2 000，见图1。

图1 对照品及神香草样品330 nm高效液相色谱图：A为溶剂峰；B、C为对照品色谱峰；D为样品峰

4 样品处理方法

4.1 单因素试验由于迷迭香酸是一种水溶性物质，蒙花苷几乎不溶于水，二者极性差异较大，所以在实验过程中采用综合评分的方式评价迷迭香酸和蒙花苷提取效果，且神香草中迷迭香酸含量高于蒙花苷的含量，因此迷迭香酸权重系数占比高于蒙花苷的权重系数。

综合评分=迷迭香酸含量/迷迭香酸最高含量×0.6+蒙花苷含量/蒙花苷最高含量×0.4。

4.1.1 提取方法的考察 取神香草药材粉末（过筛）6份，分为两组，每组平行操作3次，精密称定各0.5 g，于具塞锥形瓶中，精密吸取25 mL甲醇，称重，每组分别采用加热回流和超声法提取（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放冷，补足减失的重量，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，以迷迭香酸、蒙花苷的综合评分作为指标进行比较。结果显示，超声法提取效果最佳。结果见表1。

表1 提取方法对测定结果的影响（n=3）

4.1.2 提取溶剂的考察 取神香草药材粉末 （过筛）24份，分为8组，每组平行操作3次，精密称定各0.5 g，于具塞锥形瓶中，每组分别精密吸取25 mL甲醇、80%甲醇、60%甲醇、40%甲醇、95%乙醇、80%乙醇、60%乙醇、40%乙醇，称重，超声法提取30 min，放冷，补足减失的重量，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，以迷迭香酸、蒙花苷的综合评分作为指标进行比较。结果显示，提取溶剂为60%甲醇时提取效果最佳。见表2。

表2 提取溶剂对测定结果的影响（n=3）

4.1.3 提取溶剂的用量的考察 取神香草药材粉末（过筛） 12份，分为4组，每组平行操作3次，精密称定各0.5 g，于具塞锥形瓶中，每组分别按料液比1∶10、1∶20、1∶50、1∶100精密吸取60%甲醇，超声法提取30 min，放冷，补足减失的重量，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，以迷迭香酸、蒙花苷的综合评分作为指标进行比较。结果显示，提取溶剂的加入量为25 mL提取效果最佳。结果见表3。

表3 料液比对测定结果的影响（n=3）

4.1.4 超声处理时间的选择 取神香草药材粉末（过筛） 12份，分为4组，每组平行操作3次，精密称定各0.5 g，于锥形瓶中，精密吸取60%甲醇25 mL，采用超声法分别提取10、15、20、30 min，放冷，补足减失的重量，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，以迷迭香酸、蒙花苷的综合评分作为指标进行比较。结果显示，提取时间为20 min提取效果最佳。结果见表4。

表4 提取时间对测定结果的影响（n=3）

4.1.5 提取功率的考察 取神香草药材粉末（过筛） 12份，分为4组，每组平行操作3次，精密称定各0.5 g，于锥形瓶中，精密吸取60%甲醇25 mL，超声功率分别为150、250、350、500 W提取20 min，放冷，补足减失的重量，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，以迷迭香酸、蒙花苷的综合评分作为指标进行比较。结果显示，提取功率为350 W提取效果相对较好。结果见表5。

表5 提取功率对测定结果的影响（n=3）

4.1.6 提取次数的选择 取神香草药材粉末（过筛）9份，分为3组，每组平行操作3次，精密称定各0.5 g，于具塞锥形瓶中，精密吸取60%甲醇25 mL，采用超声法分别提取1、2、3次（20分/次），放冷，补足减失的重量，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，以迷迭香酸、蒙花苷的综合评分作为指标进行比较。结果显示，提取2次时提取效率最高，为提取方法操作方便简单，故选择提取次数为2次。见表6。

表6 提取次数对测定结果的影响（n=3）

4.2 提取工艺重复正交试验结合单因素试验的结果，以神香草中迷迭香酸和蒙花苷两种成分含量的综合评分作为考察指标，选择对迷迭香酸、蒙花苷提取效果影响较大的提取溶剂（A）、料液比（B）、提取时间（C）、提取次数（D）为考察因素，每个因素选取3个水平，按照L9（34）正交表进行重复性正交试验，确定其最优提取工艺。神香草因素水平见表7，试验安排及结果见表8，方差分析结果见表9。

表7 正交试验因素水平表

各因素水平的变化对实验结果大小的影响可以通过各因素、水平的极差R值的大小直观反映，极差值越大影响越大，反之越小。因此由表8分析结果中可以直观看出四个因素对迷迭香酸和蒙花苷提取率影响的显著性依次是：B＞C＞A＞D，料液比在本次试验中是影响提取的最重要因素，其次是提取时间、提取溶剂，提取次数影响最小，最佳提取工艺为A1B1C1D1，即提取溶剂100%甲醇溶液、料液比1∶20、提取时间15 min、提取次数1次。从表9方差分析结果可知，因素B（料液比）、因素C（提取时间）差异有统计学意义（P＜0.05），而因素A（提取溶剂）、D（提取次数）差异无统计学意义。A因素兼顾药材中迷迭香酸和蒙花苷的提取率，由于二者极性差异较大，迷迭香酸含量高于蒙花苷，因此选择60%甲醇最合适，结合直观分析和方差分析应该选择A3B1C2D1，即提取溶剂60%甲醇溶液、料液比1∶20、提取时间20 min、提取次数1次。

表8 L9（34）正交试验安排及结果（n=27）

表9 正交试验方差分析表

4.3 最佳提取工艺条件验证按上述神香草最佳提取工艺A3B1C2D1，即提取溶剂60%甲醇溶液、料液比1∶20、提取时间20 min、提取次数1次条件进行3次平行验证试验，结果见10。

表10 验证试验结果/%

5 讨论

单因素试验表明，各个因素在相互不影响的情况下提取神香草中迷迭香酸和蒙花苷的最佳条件为100%甲醇溶液、料液比1∶50、提取功率350 W、提取时间为20 min、提取次数2次。但在实际操作过程中各个因素存在相互影响的情况，考虑实际生产过程中所消耗时间和资源成本等系列问题，本次实验选取操作简便、快捷迅速的超声提取法，故在超声提取的基础上，选取4个因素分别为提取溶剂、提取功率、提取时间和提取次数作为考察指标。正交试验结果表明，提取溶剂的加入量是影响提取效果的占比重要的因素，其次为提取时间、提取溶剂，提取次数是最小的影响因素。