猪圆环病毒3型PCR-ELISA检测方法的研究与应用

李 鹏，孙延举，雷梦瑶，孙国鹏，银 梅，苏为为，王选年，刘兴友，王利平*

(1.新乡学院 生命科学与基础医学学院，河南 新乡 453003；2.河南科技学院 动物科技学院，河南 新乡 453003)

猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)，是一种单链环状DNA病毒，基因组大小1.7～2.0 kb，无包膜，病毒粒子约为20 nm的二十面体[1]。已知有4种PCV(PCV1～4)可感染猪[2]，其中PCV1为非致病性病毒，PCV2则可引起多种疾病发生，包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、皮炎和肾病综合征、繁殖障碍等疾病[3-4]。2016年，美国首次报道检出PCV3，此后世界各地猪场分别检出PCV3病原，并发现其与猪的多种临床疾病有关，包括流产和产木乃伊胎、多系统炎症、皮炎和肾病综合征、腹泻和呼吸道疾病、先天性震颤等[5-6]。且通过对病变组织原位杂交(ISH)试验显示，PCV3与发病仔猪的心肌炎、血管炎和脑炎有关[7]。由于猪群在感染PCV3和PCV2后具有相似的临床体征，因此研发PCV3高敏感性和特异性检测方法具有重要的临床意义。

PCR-ELISA是一种包含基因扩增、核酸杂交和酶联免疫分析的检测方法[8]。与常规PCR相比，不仅大幅度提升了灵敏度，还可用于大规模样品的半定量分析[9]。本研究针对PCV3基因高度保守序列设计特异性引物，分别标记生物素和地高辛标，利用链霉亲和素与生物素之间特异性结合的原理，使PCR产物牢牢的结合在酶标板上，然后进行ELISA检测。PCR-ELISA将PCR与ELISA高灵敏性的特性有效的结合，消除了PCR凝胶电泳灵敏度低和ELISA样品制备复杂等过程，降低了试验难度，有效提高了检测的特异性和灵敏性，为PCV3的预防与控制提供了一定的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 病毒株猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)、猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3,PCV3)阳性病料均由动物疫病分子诊断河南省工程实验室保存提供。

1.2 主要试剂病毒核酸提取试剂盒、DL2000 DNA Marker、pMD19-T载体、E.coliDH5α感受态细胞、QuickCutTMBamHⅠ、QuickCutTMHind Ⅲ和Premix Taq酶均购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒采购自OMEGA公司；链霉亲和素、羊抗DIG-HRP采购自Merck公司。

1.3 引物设计从GenBank数据库下载具有代表性的国内外PCV3全基因组序列，并使用DNAMAN软件进行比对，确定高度保守区域。用Primer 5.0软件设计特异引物，同时标记生物素与地高辛，上游引物PCV3-BIOF序列：5′-BIO-TGCTAC-GAGTGTCCTGAAGA-3′，下游引物PCV3-DIGR序列：5′-DIG-CTGCTGCTTGAAGATCCGAT-3′。引物由上海生工合成，同时合成1对未标记引物。

1.4 PCR退火温度筛选以提取的PCV3基因组DNA为模板，使用引物PCV3-BIOF和PCV3-DIGR进行扩增。反应体系：Premix Taq 25 μL，模板DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O补齐至50 μL。反应程序：95℃ 4 min；95℃ 30 s，50～60℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 10 min。以条带最亮的温度作为最佳退火温度进行PCR反应。

1.5 标准质粒的制备使用未标记引物按照1.4进行PCR反应，目的基因片段回收纯化后连接至pMD19-T载体，再转化进DH5α感受态细胞，提取质粒，使用菌液PCR和双酶切(BamHⅠ和Hind Ⅲ)鉴定后测序分析，然后测定PCV3标准质粒的质量浓度并转换成相应拷贝数，以此作为PCR-ELSIA检测的标准品。

1.6 PCR-ELISA检测将链霉亲和素使用PBS缓冲液稀释后，50 μL/孔加入酶标板，于4℃包被过夜。弃去包被液后使用PBST 300 μL/孔重复洗板6次，拍干后每孔加入200 μL 5%脱脂奶于37℃封闭2 h。洗板6次拍干，加入带有标记物的PCR扩增产物，50 μL/孔37℃孵育1 h。洗板6次拍干，加入使用封闭液稀释的羊抗DIG-HRP，50 μL/孔，于37℃反应1 h。洗板6次拍干，每孔加入50 μL TMB单组份显色液，避光显色10 min，50 μL/孔加入H2SO4终止液，最后用酶标仪读取D450 nm值。

1.7 PCR-ELISA检测方法的优化对PCR-ELISA的各个主要反应条件进行优化。筛选链霉亲和素包被质量浓度(20.000 0，10.000 0，5.000 0，2.500 0，1.250 0，0.625 0，0.312 5 mg/L)和包被条件(4℃过夜，37℃ 2 h，37℃ 1 h，37℃ 30 min和37℃ 15 min)，以5%脱脂奶作为封闭液筛选封闭条件(37℃ 2 h，37℃ 1 h，37℃ 45 min，37℃ 30 min和37℃ 15 min)，加入PCR产物的反应时间(60，45，30，15，5 min)进行优化，再对羊抗DIG-HRP的稀释度(1∶500，1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000 和1∶16 000)及反应时间(60，45，30，15，5 min)进行筛选。根据以上筛选出的条件，优化PCR-ELISA的显色时间(15，10，7，5，3，1 min)及PCR反应时的循环次数(35，30，25，20，15，10次)，确定PCR-ELISA的最佳反应条件。

1.9 特异性试验使用优化反应条件后的PCR-ELISA检测方法分别检测PRRSV、CSFV、PPV、PCV2和PCV3样品，确定PCR-ELISA方法的特异性。

1.10 敏感性试验将鉴定成功的PCV3标准质粒做10倍梯度稀释，以此为模板进行检测，每个梯度设置3个重复，以各梯度D450 nm均值确定PCR-ELISA检测方法的敏感性。

1.11 重复性试验选取4份不同质量浓度的PCV3标准质粒以及1份PCV3阴性样品，使用同批次的5块酶标板同时对其进行检测，再使用不同批次制备的酶标板检测该PCV3阳性和阴性样品，进行批内和批间重复性检测，每个样品设置3个重复。通过计算不同批次酶标板上各样品的D450 nm值的变异系数(CV)，测定PCR-ELISA的稳定性。

1.12 临床样品的检测临床收集132份猪的组织和血清样品，使用建立的PCR-ELISA方法进行PCV3检测，同时使用常规PCR作对比，统计并分析临床样品的PCV3阳性率。

2 结果

2.1 目的基因PCR扩增及退火温度筛选结果以提取的PCV3全基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果显示，出现392 bp左右的目的条带，同预期相符。退火温度筛选(50，51，53，55，57，60℃)结果见图1，当退火温度为55℃时，有较好的PCR扩增效果。

M.DL2000 DNA Marker；1.50℃；2.51℃；3.53℃；4.55℃；5.57℃；6.60℃；7.阴性对照

2.2 标准质粒的制备结果使用未标记引物按2.1确定的PCR反应条件，以PCV3 DNA为模板进行PCR反应，获得的目的产物经回收纯化、连接载体、转化、克隆后得到重组克隆质粒，经PCR和双酶切确定插入的片段大小在392 bp左右(图2)。测序结果显示同PCV3参考毒株的基因同源性为100%，表明成功构建PCV3目的基因克隆质粒。测得其质量浓度为188.7 mg/L，换算成拷贝数为5.58×1010copies/μL。

M.DL2000 DNA Marker；1.重组质粒PCR鉴定；2.阴性对照；3.重组质粒双酶切鉴定；4.阴性对照

2.3 PCR-ELISA检测方法优化结果对PCR-ELISA检测方法的反应条件优化结果显示，PCR循环次数为30次，链霉亲和素最佳包被质量浓度为2.5 mg/L，包被条件为37℃ 30 min，5%脱脂奶于37℃封闭60 min，目的基因的固定条件为37℃ 60 min，羊抗DIG-HRP按1∶2 000稀释后于37℃反应30 min，TMB显色10 min。

图3 30份阴性样品D450 nm的正态分布图

2.5 PCR-ELISA特异性试验结果利用建立的PCR-ELISA检测方法对PRRSV、CSFV、PPV、PCV2和PCV3样品进行检测，结果显示，仅PCV3样品为阳性(D450 nm=0.807)，与其他病原体无交叉反应(图4)；表明该方法具有良好的特异性。

图4 特异性试验结果

2.6 PCR-ELISA敏感性试验结果将构建的PCV3标准质粒做10倍梯度稀释，以得到的5.58×109～5.58×101copies/μL质粒为模板，使用建立的PCR-ELISA方法进行检测，同时以常规PCR做对比。结果显示，常规PCR可检测到5.58×104copies/μL的样品，PCR-ELISA可检测到5.58×102copies/μL(图5,6)；表明该方法具有良好敏感性，其灵敏度是常规PCR的100倍。

M.DL2000 DNA Marker；1～9.分别是PCV3质粒稀释浓度5.58×109～5.58×101 copies/μL；10.阴性对照

图6 PCR-ELISA敏感性试验

2.8 临床样品检测应用建立的PCR-ELISA检测方法检测临床收集的132 份猪的病料组织和血清样品，同时使用常规PCR检测以做比对。结果显示，常规PCR测定临床样品中PCV3阳性率为4.55%(6/132)，PCR-ELISA检测样品阳性率为9.10%(12/132)，且常规PCR检测阳性样，在PCR-ELISA检测时均为阳性(表2)；表明所建立的PCV3 PCR-ELISA方法可用于临床样品的检测。

表1 PCR-ELISA重复性试验结果

表2 临床样品PCR-ELISA方法和常规PCR方法检测结果 份

3 讨论

自2016 年美国首次报道PCV3后，至今仍无有效的疫苗和药物用于防控[10]。另外，PCV3宿主范围不断扩大，已从犬[11]和驴[12]样品中检测到PCV3。加之无症状感染和混合感染，使PCV3的临床诊断和预防控制难度增加，对各国养猪业造成严重不良影响[13]。建立一种灵敏、特异、高效的检测方法用于PCV3的早防早控，对减少经济损失意义重大。

PCR-ELISA技术通过结合固定化技术、引物标记、PCR扩增和酶联免疫吸附技术，极大增强了目的基因的信号强度，同时使用酶标仪读取和量化结果，做到对目的基因的半定量检测[14]。与常规PCR方法相比，PCR-ELISA在大幅度提升灵敏度基础上省去了凝胶电泳步骤，避免了EB等核酸染料的污染[15]。且该方法使用标准实验室仪器即可完成样品的批量检测，适合在养殖场推广使用。本研究分别在引物的5′端标记生物素和地高辛，PCR扩增后目的产物带有的标记物可直接与载体固定，省去了传统PCR-ELISA技术的探针设计和变性杂交步骤，缩短了检测时间，降低了检测成本。在此基础上，通过对链霉亲和素的包被条件、酶标板封闭条件、目的基因和载体的固定条件、酶标抗体反应条件、显色时间、PCR循环次数等操作步骤进行筛选优化，建立了检测PCV3的PCR-ELISA方法。

对所建立的PCR-ELISA方法进行敏感性评价，结果显示，检测限为5.58×102copies/μL，而常规PCR的检测限为5.58×104copies/μL，表明其具有良好的敏感性，是常规PCR的100倍，这与杨利峰等[16]和耿昕颖等[17]的研究结论一致。使用建立的PCR-ELISA方法，对132 份猪病料组织和血清样品进行PCV3 PCR-ELISA检测，结果显示，阳性率为9.10%，这同赵胜杰等[18]和JIA等[19]报道的PCV3在河南省的流行率5.17%～10.10%相近。在检出的12份PCV3阳性样品中，有7份样品同时为PCV2阳性，说明PCV3常和PCV2发生混合感染[20]，但其感染机制仍有待研究。

综上所述，本研究建立并优化了一种用于PCV3的PCR-ELISA检测方法，该方法具有较高的灵敏性和重复性，适用于PCV3的早期诊断、日常监测和流行病学调查。