基于网络药理学和体外验证实验探索斑蝥素治疗肝癌的作用机制

汪姣，包良，杜吉雅，张菱芳，王海生

（内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010059）

肝癌是常见的恶性肿瘤，是发病率和病死率最高的5种癌症之一［1］。肝癌治疗方法多样，目前临床以手术治疗、化疗、放疗和靶向治疗等疗法为主［2］。因肝癌早期症状不明显，患者就诊时多为中晚期，不再适合手术治疗，晚期肝癌患者的治疗方法有限，且复发率高、易发生转移。中医药疗法在治疗肝癌的过程中有预防复发、转移等优点［3］。

斑蝥素（cantharidin）是传统中药斑蝥的有效提取成分，研究表明其对胃癌、肺癌、乳腺癌和胰腺癌等多种肿瘤细胞具有较强的抑制作用［4］。斑蝥素可通过阻滞肝癌细胞周期使其停滞在G2/M 期，有效抑制其增殖，并促进凋亡，从而发挥抗癌效应［5］；还可通过下调P－糖蛋白表达情况，逆转肝癌HepG2/ADM 的多药耐药性［6］。目前，针对斑蝥素治疗肝癌的机制进行了大量研究，但主要以单靶点、单通路的作用机制为主，对其潜在的机制尚未进行系统的研究。因此，笔者运用网络药理学和分子对接技术进一步对斑蝥素治疗肝癌的作用机制进行系统分析，以期为后续研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

人肝癌细胞株HepG2 细胞为本实验室冻存，在37 ℃、5%CO2的细胞箱中培养。

1.1.2 试验药物、主要试剂及仪器

斑蝥素（美国Sigma公司，25 mg/瓶，批号：C7632），溶于DMSO 溶液中，配制成50 mmol/L 的母液，在−20 ℃冰箱中保存备用。

1640 培养基、胎牛血清（美国Gibco 公司，批号：8121174、2117119）；CCK－8（大连美仑生物技术有限公司，批号：MA0218－5－May－15E）；RIPA 裂解液（上海尚宝生物科技有限公司，批号：1092891）；二甲基亚砜（DMSO，北京索莱宝有限公司，批号：67－68－5）；RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒（日本Takara 生物公司，批号：PK0542、AKG0730A、AKE1154A）；Akt、PT3K（美国Affinity 公司，批号：AF6214、AF6261）；ECL 显色液（美国伯乐公司，批号：102031721）；BCA 蛋白定量试剂盒（美国Thermo 公司，批号：VL316399）；Matrigel 胶（上海碧云天有限公司，批号：120420210222）。

多功能酶标仪（美国thermo公司）；PCR 仪（美国罗氏公司）；电泳仪、转膜仪（美国伯乐公司）。

1.2 方法

1.2.1 斑蝥素靶点的筛选

通过PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库获取斑蝥素的2D 结构和SMILES 表达式，运用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：//old.tcmsp－e.com/tcmsp.php）和SwissTargetPrediction（https：//www.swisstargetprediction.ch/）数据库，将Organism 设置为Homo Sapiens（人类），入选预测概率选择大于0，将两个数据库中获得的靶点合并去重，得到斑蝥素的预测靶点。

1.2.2 肝癌靶点的获取

以“liver cancer”为关键词进行检索，在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）和TTD 数据库（http：//db.idrblab.net/ttd/）中获取肝癌的潜在靶点。在GeneCards数据库中，Score值越高则代表该靶点与疾病联系越密切，因此，以Score值为条件，将Score值大于中位数的靶点选择为肝癌的潜在靶点。合并两个数据库中获得的交集靶点，删除重复，得到疾病相关的靶点。利 用Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）对药物作用靶点和疾病靶点取交集，得到“斑蝥素－肝癌”共同靶点31个。

1.2.3 蛋白质相互作用（PPI）网络构建及核心蛋白的筛选

运用STRING 数据库，输入31个共同靶基因，将物种设置为Homo Sapiens，选择交互作用大于0.4，去除游离节点，下载“tsv”格式的数据，将其导入Cytoscape 3.7.2软件中，构建PPI 网络。将同时满足Degree、Betweenness 和Closeness 三项数据，并在平均值之上的靶基因选为核心靶点。

1.2.4 GO功能富集和KEGG通路富集分析

基于DAVID 数据库（https：//david.abcc.ncifcrf.gov/）进行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析。将得到的交集靶点基因上传至DAVID 数据库，并以P<0.05为筛选条件，将结果绘制成气泡图。

1.2.5 分子对接

从TCMSP数据库下载斑蝥素mol2结构，从蛋白数据PDB 数据库（http：//www.rcsb.org/）中选择下载核心靶点度值前6 的蛋白质3D 结构的pdb 格式文件，并要求所选择的蛋白尽量满足以下条件［7］：①选择物种为人；②蛋白质结构中必须有1 个或多个小分子配体；③分辨率高；④pH 值接近人体正常生理范围。利用AutoDock 4.2.6 软件进行分子对接，并通过Pymol 2.4.0软件将对接结果可视化。

1.2.6 CCK检测HepG2增殖

HepG2细胞以浓度1×105/mL均匀接种至96孔细胞培养板中，每孔100 μL。待细胞贴壁后分别加入终浓度为0、2.5、5、10、20 μmol/L的斑蝥素，培养24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK－8试剂，继续培养2 h。用酶标仪测定450 nm波长的光密度值（optical density，OD）。

1.2.7 实时荧光定量聚合酶链式反应（Real－time PCR）检测mRNA的水平

按照Trizol 试剂（Invitrogen）说明书提取实验组和对照组的细胞内总RNA，采用Nanodrop ND－1000 测定RNA 的浓度和纯度，使用cDNA 逆转录试剂盒（TaKaRa）对1 μg 的RNA 进行逆转录，再以cDNA 为模板，以10 μL 的反应体系进行PCR 反应。反应条件为95 ℃预变性30 s，PCR 反应：95 ℃变性5 s，60 ℃延伸45 s，72 ℃退火10 s，进行45个循环。引物序列见表1，以GAPDH 作为内参对照，结果以2－ΔΔCt表示mRNA 相对表达量。

表1 核心靶蛋白引物序列表

1.2.8 Western blot法检测蛋白的表达

细胞接种至6 孔培养板中，用5 μmol/L 斑蝥素分别刺激细胞0、3、5、10、15 min，加入含1 mmol/L PMSF的RIPA 裂解液裂解细胞。12 000 r/min、4 ℃离心20 min，取上清，按照BCA 试剂盒说明书测定蛋白浓度。按每15 μL 蛋白样品加入5 μL 蛋白上样缓冲液，100 ℃变性5 min 后，经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品、半干转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入一抗PI3K（1∶2 000）、Akt（1∶2 000）、GAPDH（1∶1 000）在4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入山羊抗兔二抗（1∶100 000）室温孵育2 h，TBST 洗膜3 次，每 次10 min。ECL 显色液以1∶1 体积比混合滴在PVDF 膜上，使用凝胶成像拍照，利用Image J 软件定量目标条带的相对蛋白表达水平。

1.3 统计学方法

数据采用GraphPad Prism 7 软件进行统计学处理，以均数± 标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 靶点的筛选

从TCMSP 和Swiss Target Prediction 中共获得斑蝥素的靶点53个，去除重复靶点后得到32个靶点。利用GeneCards 数据库和TTD 数据库，选择Relevance Score值大于中位数的为肝癌的靶点。从TTD 数据库中获取1 468 个，GeneCards 数据库获得8 408 个，将两个数据库中筛选出的靶点合并、去重后共得到8 408个肝癌的靶点，运用Venny 2.1 平台取交集后得到31 个共同靶点，分别是PPP2R2A、ADORA2B、ABCB1、POLB、CASP3、PTPN1、HSD11B1、BIRC5、PTGES、OPRK1、PTGS2、FGFR4、GABRA1、STAR、OPRM1、PRKCA、ELANE、UGT2B7、PREP、BCL2、PPP5C、CDC25A、PRKCD、VDR、PPP1CA、HMGCR、CAMK4T、P53、PTEN、PPP1CC和BAX。

2.2 斑蝥素与肝癌PPI 网络的构建及核心靶点的筛选

上传得到的交集靶基因至STRING 数据库，然后下载数据导入Cytoscape 3.7.2 软件构建PPI 网络图，结果见图1，其中包含26 个节点和61 条连线，节点代表靶点，依据度值（Degree）设定，颜色由浅到深代表度值由小到大。对网连线则代表靶点之间的相互作用。节点颜色和大小络中的节点进行拓扑分析得到度值、介度、紧密度的中位数分别为4、0.004 9、0.458 8，将同时满足大于度值、介度、紧密度3个参数中位数的靶点列为核心靶点，参数见表2。由此推断TP53、PTEN、CASP3等核心靶点在斑蝥素治疗肝癌的过程中起着重要作用。

图1 交集靶点PPI网络图

表2 核心靶点及相关参数

2.3 GO分类富集和KEGG通路富集分析

基于DAVID 数据库对交集靶点进行富集分析（P<0.05），以P值为筛选条件，选择排名前十条绘制成气泡图，见图2和图3。GO 分类富集分析显示，斑蝥素在治疗肝癌的过程中参与了87 条生物过程（BP）（图2a），主要包括蛋白质去磷酸化、细胞增殖、细胞周期的调控等；涉及21 条分子功能（图2b），主要为蛋白结合、酶结合、蛋白质磷酸酶活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性、蛋白磷酸酶2A结合、蛋白磷酸酶活性等。GO 分类富集分析得出16 条细胞组分（图2c），主要包括细胞质、细胞液、细胞核、内质网、线粒体、内质网的膜、蛋白复合体等。

图2 斑蝥素治疗肝癌交集靶点的GO分析图

KEGG 富集31 条信号通路，依据P值大小排名前二十的结果见图3，主要涉及乙型肝炎通路、鞘脂类信号通路、PI3K/Akt 信号通路、MAPK 信号通路、细胞凋亡、p53信号通路等。

图3 KEGG通路富集分析

2.4 斑蝥素治疗肝癌的分子对接

将核心靶点度值（Degree）前6 的靶点进行分子对接，进一步验证斑蝥素和肝癌的结合活性。结合自由能（Binding energy）可以评估受体和配体之间的亲和性，一般认为结合能<0 kJ/mol 表明配体分子和受体蛋白能够自发结合，结合能<−5 kJ/mol 表明两者能够较好结合［8］。结果显示斑蝥素与核心靶点TP53、PTEN、CASP3、PTGS2、PRKCD、ABCB1 之间均有较好的结合活性。见表3和图4。

图4 斑蝥素治疗肝癌的分子对接图

表3 斑蝥素治疗肝癌关键靶点结合能

2.5 斑蝥素抑制人肝癌HepG2细胞的增殖

采用CCK 法检测不同浓度的斑蝥素作用于HepG2细胞24、48、72 h后对其增殖的影响。结果与空白对照组（0 μmol/L）相比，斑蝥素能显著抑制人肝癌HepG2 细胞的增殖，并呈时间和剂量依赖性。见图5。

2.6 斑蝥素影响HepG2相关基因的表达

采用Real－time PCR 法检测斑蝥素作用于HepG2细胞后核心靶点mRNA 的表达情况。结果与对照组相比，斑蝥素干预组（5 μmol/L）中ABCB1（2.46 ±0.64）（P=0.017 3 <0.05）、PTEN（1.30 ± 0.13）（P=0.032 5 <0.05）、PTGS2（1.42 ± 0.07）（P=0.022 3 <0.05）和TP53（1.43 ± 0.01）（P=0.000 0 <0.01）的mRNA 表达明显升高，差异具有统计学意义，而CASP3（1.04 ± 0.12）（P=0.43）和PRKCD（1.11 ± 0.08）（P=0.58）的mRNA 表达差异不具有统计学意义，说明斑蝥素能够上调ABCB1、PTEN、PTGS2 和TP53 的表达。见图5。

图5 斑蝥素对HepG2细胞增殖及核心靶蛋白mRNA表达的影响

2.7 斑蝥素对HepG2细胞PI3K/Akt信号通路的影响

5 μmol/L 斑 蝥 素 作 用 于HepG2 细 胞3、5、10、15 min 后，与空白对照组（0 min）相比，5 μmol/L 斑蝥素组的PI3K、Akt 蛋白表达显著下调（P<0.05），说明斑蝥素对PI3K/Akt 信号通路具有抑制作用。见图6。

图6 斑蝥素对PI3K/Akt 信号通路的影响

3 讨论

大量研究证明，斑蝥素对多种癌细胞具有抗肿瘤的活性，但其作用机制复杂，以往的研究多以单靶点、单通路为主。本研究运用网络药理学和分子对接技术，从分子角度全面分析了斑蝥素治疗肝癌的潜在作用机制。结果显示，斑蝥素可通过TP53、PTEN、PTGS2及ABCB1等多个核心靶点发挥作用。TP53（细胞肿瘤抗原p53）是一种重要的肿瘤抑制因子，可通过调节DNA修复、细胞周期阻滞等多种细胞反应防止癌症的发生和发展［9］，部分肝癌的发生与p53基因的缺陷或突变密切相关［10］。TIAN 等［11］研究发现斑蝥素可通过上调TP53 抑制癌细胞的增殖和促进凋亡。PTEN基因是一种具有双特异性磷酸酶活性的肿瘤抑制基因，其表达下调可导致肿瘤血管生成增加，促进肿瘤细胞的增殖［12］。PTGS2又称环氧合酶－2（COX－2），在多种癌细胞中表达增加，研究表明COX－2 抑制剂对肝癌细胞有良好的抑制增殖及诱导凋亡功效［13］。而ABCB1在肝癌中高表达与肝癌的高耐药性相关［14］。

GO分类富集分析结果显示，斑蝥素发挥的肝癌治疗作用与细胞凋亡和细胞周期密切相关，早期的研究发现斑蝥素可通过下调β－catenin 和细胞周期蛋白（cyclin）的表达，诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞在G2/M 期，抑制肝癌细胞增殖和自我更新［5］，这也与本文的分析结果相一致。

KEGG 富集结果表明，共同靶点主要富集在PI3K/Akt、乙型肝炎通路、鞘脂类通路等。PI3K/Akt 在细胞的生长、增殖、代谢过程中发挥着重要作用，与肝癌的发生、发展转移和耐药等方面密切相关［15］。有研究发现斑蝥素通过下调EphB4 表达，调节JAK2/STAT3 和PI3K/Akt通路抑制肝癌［16］。为了进一步验证网络药理学预测的科学性，本研究以HepG2 细胞为模型细胞，对预测的主要靶点和通路进行了实验验证，结果发现斑蝥素能够上调TP53、ABCB1、PTEN 和PTGS2 的mRNA 表达，下调PI3K/Akt 通路中PI3K、Akt 蛋白的表达，从而抑制HepG2细胞的增殖。

本研究运用网络药理学的方法分析了斑蝥素抗肝癌的潜在作用靶点及作用机制，并用分子对接技术和体外实验进行了验证。结果表明，斑蝥素抗肝癌具有多靶点、多通路的特点，主要通过上调TP53、PTEN、ABCB1和PTGS2 等靶点的mRNA 表达，抑制PI3K/Akt 信号通路的激活以及HepG2细胞的增殖实现抗肝癌的作用。