基于网络药理学探究温补固肾方治疗糖尿病肾病的作用机制及实验验证

禹静，刘续春，李振华

（1.黄淮学院直属附属驻马店市中心医院，河南 驻马店 463000；2.郑州市中心医院 河南 郑州 450001）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病诱发的微血管并发症之一。近年来糖尿病的发病率不断升高，预计到2040 年全球糖尿病患者人数预计达6.42 亿，其中30%～ 40%的糖尿病患者会发展成为DN［1］。DN 是终末期肾病最常见的原因，与心血管疾病风险升高密切相关［2］。但是目前有关DN 的治疗仍无完美的治疗方案，只能通过饮食控制、降压、降血糖，减少尿蛋白等手段进行对症治疗，疗效欠佳。随着中医药防治DN 理论和临床研究的不断深入，其在治疗DN 中的作用日显突出。温补固肾方（Wenbu Gushen Prescription，WBGSF）由党参，山茱萸，芡实，枸杞子，覆盆子，菟丝子，淫羊藿及益智仁组成。全方以温阳补肾固肾为治疗根本大法，佐以收涩补气之品［3］。既往研究发现，WBGSF 能够改善慢性肾病伴肾小管间质损害患者临床症状［3］。温补固肾方配方芡实能够调节基质金属蛋白酶－9/基质金属蛋白酶抑制剂－1间平衡，降解胶原蛋白Ⅳ，减轻肾小管间质纤维化，降低尿蛋白，从而改善DN 肾功能［4］。但是目前有关WBGSF 对DN的影响及作用机制尚不清楚。网络药理学是通过研究中药活性成分－潜在靶点－疾病治疗之间复杂网络关系的新型方法，是初步探究中药治疗疾病的作用机制新思路［5］。本研究拟通过网络药理学挖掘出WBGSF 治疗DN 的潜在靶点和作用通路，探讨可能作用机制，同时采用动物实验构建DN 大鼠模型，观察WBGSF 对DN 大鼠的治疗效果并对网络药理学结果进行验证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

SPF 级，雄性，SD 大鼠，6～ 8 周龄，体质量180～200 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司（生产许可证号：SCXK（沪）2018－0002）。大鼠适应性喂养1 周，期间正常饮食、饮水，昼夜12 h/12 h交替光照，温度（25±2）℃，相对湿度45%～55%，动物实验经我院医学伦理委员会批准（批准号：20191002），并符合3R原则。

1.1.2 药物与主要试剂

温补固肾方免煎制剂组成：党参，山茱萸，芡实，枸杞子，覆盆子，菟丝子，淫羊藿和益智仁均购自广东一方制药有限公司；链脲佐菌素（STZ）（Sigma－Aldrich，货号：S0130）；苏木素伊红（hematoxylin－eosin，HE）染色试剂盒、Masson染色试剂盒、细胞裂解液、蛋白marker、BCA试剂盒、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗、ECL 发光试剂盒、β－actin 一抗（上海碧云天生物技术公司，货号：C0105M、T4131、P0013、P0075、P0012、A0408、A0412、P0018S、AF5001）；晚期糖基化终末产物试剂盒（advanced glycation end products，AGEs）（南京建成生物工程研究所，货号：H250－1－1）、晚期糖基化终末产物受体试剂盒（receptor for advanced glycation end products，RAGE）（美国Raybiotech公司，货号：S100A12）；RAGE一抗（美国Cell Signaling Technology公司，货号：55222）。

1.1.3 主要仪器

多功能酶标仪（长春乐镤科技有限公司，型号：LP－5117）；荧光倒置显微镜（日本/奥林巴斯Olympus，型号：CKX53）；高速冷冻离心机（湖南可成仪器设备有限公司，型号：H3－18KR）；凝胶成像系统（美国Bio－Rad伯乐公司，型号：Gel Doc XR+）。

1.2 方法

1.2.1 温补固肾方活性成分及潜在靶点

利用TCMSP 数据库以党参、山茱萸、芡实、枸杞子、覆盆子、菟丝子、淫羊藿和益智仁为关键词检索其所有化学成分，按照口服生物利用度（oral bioavailability，OB）>30%和类药性（drug likeness，DL）>0.18 进行有效活性成分筛选，之后选择Related Target项获得相关化合物名称和靶点基因。

1.2.2 糖尿病肾病相关靶点基因预测

以“diabetic nephropathy”为关键词，于“GeneCard”“OMIM”“PharmGkb”“TTD”及“DrugBank”数据库，预测糖尿病肾病相关靶点，合并5 个数据库检索结果，去除重复靶点，并通过UniProt数据库将上述靶点名称转化为基因名称。

1.2.3 温补固肾方治疗糖尿病肾病的潜在靶点基因预测

利用R 3.6.3 软件分析温补固肾方与糖尿病肾病共同靶点基因，并绘制韦恩图。

1.2.4 温补固肾方活性成分－潜在靶点－糖尿病肾病网络构建

将温补固肾方治疗糖尿病肾病共同靶点基因导入STRING 数据库，设置条件限定物种为“Homo sapiens”，靶点基因之间相互作用分值≥0.9，之后删除游离靶点基因，并获得上述蛋白质相互作用（PPI）信息，最后将靶点基因导入Cytoscape 软件进行拓扑分析以及PPI网络图构建，并取得核心靶基因网络图。

1.2.5 关键靶蛋白GO富集分析和KEGG通路分析

在BioConductor 检索相应软件包，并对筛选得到的核心靶基因进行GO功能和KEGG通路富集分析。

1.2.6 糖尿病肾病模型构建与分组给药

SD 大鼠按照随机数字表随机分为对照组（Control组）、模型组（DN 组）和温补固肾方给药低、中、高剂量组，每组各10只。DN组和温补固肾方（WBGSF）组大鼠给予腹腔一次性注射链脲佐菌素（60 mg/kg），72 h尾静脉采血测定大鼠血糖，血糖值≥16.7 mmol/L，且尿蛋白含量≥30 mg视为造模成功［6］。温补固肾方低剂量组给药量0.92 g/kg，组方：党参0.1 g，山茱萸0.12 g，芡实0.2 g，枸杞子0.1 g，覆盆子0.1 g，菟丝子0.1 g，淫羊藿0.1 g，益智仁0.1 g。温补固肾方中剂量组给药剂量1.84 g/kg，制剂组成配比是低剂量组的2倍。温补固肾方高剂量组给药剂量3.68 g/kg，制剂组成配比是低剂量组的4 倍。每日1 剂（5 mL），连续灌胃给药12 周，模型组和对照组大鼠给予等量生理盐水灌胃。

1.2.7 大鼠相关生化指标检测

大鼠尾静脉采血，血糖仪检测血糖；代谢收集24 h尿液，3 000 r/min 离心，10 min 后取上清液，依据检测试剂盒检测各组大鼠尿蛋白和尿素氮含量。

1.2.8 肾组织病理学观察

大鼠颈椎脱臼处死，取肾组织放于福尔马林－醋酸－酒精中固定、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、组织石蜡包埋、切片（3～5 μm），进行HE 和Masson 染色并于400倍显微镜下观察肾脏组织病理学变化。

1.2.9 肾组织AGEs和RAGE含量检测

收集肾组织匀浆上清，依据ELISA 检测试剂盒测定，计算AGEs和RAGE含量。

1.2.10 Western blot检测肾组织RAGE表达

肾组织加入细胞裂解液后于冰上裂解40 min，期间每8 min，涡旋1次；4 ℃，12 000 r/min，离心10 min，吸取细胞上清液；BCA法测定各组肾组织蛋白质浓度；上样（按照每孔上样量30 μg计算得出上样体积）；凝胶电泳（80 V，30 min后120 V，60 min）；湿转法转膜90 min；5%脱脂牛奶室温封闭2 h；分别加RAGE一抗及β－actin抗体（1∶2 000），4 ℃孵育过夜；加对应的山羊抗兔二抗或者山羊抗鼠二抗（1∶5 000），室温孵育1～2 h；加吐温20磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，每次5 min，加入显影液，显影并拍照。以目的蛋白条带灰度值与β－actin 条带灰度值的比值反映RAGE蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析

SPSS20.0 用于数据分析，数据以均数± 标准差（）表示，多组间比较采用F检验，组间比较采用t检验。P<0.05代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 WBGSF方活性成分筛选及靶点预测

通过检索TCMSP 数据库，检索党参、山茱萸、芡实、枸杞子、覆盆子、菟丝子、淫羊藿和益智仁符合OB和DL 参数条件标准的非重复活性成分81 个，主要有异鼠李素、山柰酚、木犀草素、槲皮素、菠菜甾醇和大豆黄素等。利用TCMSP 数据库靶点预测技术，对上述活性成分进行作用靶点预测，排除重复靶点后共获得潜在作用靶点260个。

2.2 糖尿病肾病疾病靶点

以“diabetic nephropathy”为关键词，于“GeneCard”“OMIM”“PharmGkb”“TTD”及“DrugBank”数据库，预测糖尿病肾病相关靶点，结果分别获得疾病相关靶点3 422、183、100、22 和40 个，剔除重复靶点后，共获得糖尿病肾病相关靶点3 573个。见图1。

图1 糖尿病肾病相关靶点筛选韦恩图

2.3 化合物靶点和疾病靶点

将3 573 个疾病靶点和81 个化合物的260 个作用靶点取交集，获得共同作用靶点148个。进一步建立中药化合物－靶点PPI 网络图，将共有靶点信息输入STRING 数据库，将输出结果tsv 文件导入Cytoscape 3.7.0 软件，构建靶蛋白PPI 网络，并进一步行拓扑分析。通过计算Betweenness、Closeness Degree、Eigenvector、LAC和Network 值，并以每个基因上述指标大于中位值为筛选条件，最终获得核心作用靶点21 个，主要包括MAPK14、AKT1、CASP3、EGFR、凋亡相关基因以及炎症相关基因等。见图2和图3。

图2 温补固肾方－潜在靶点PPI网络图

图3 温补固肾方－潜在靶点－糖尿病肾病共同作用靶点拓扑分析

2.4 GO和KEGG富集分析

利用R软件及相关程序包对WBGSF治疗糖尿病肾病的148个关键靶点进行GO和KEGG富集分析。将GO富集过程中的分子生物学过程、分子功能及细胞成分和KEGG 通路按照P值升序排列，取前10 位做气泡分析，若未满10个，则全部纳入分析。其中GO功能富集分析显示WBGSF 治疗DN 的生物学过程主要包括cellular response to chemical stress，response to oxidative stress 及response to metalion 等；分子功能包括RNA polymeraseⅡ－specific DNA－binding transcription factor binding、DNA－binding transcription factor binding 和 nuclear receptor activity 等；而细胞成分主要包括membrane raft、membrane microdomain 和membrane region 等。KEGG 通路富集分析显示WBGSF治疗DN的主要信号通路包括Lipid and atherosclerosis、AGE－RAGE signaling pathway in diabetic complication等。见图4和图5。

图4 WBGSF治疗糖尿病肾病GO功能富集分析

图5 WBGSF治疗糖尿病肾病的KEGG通路富集分析

2.5 各组大鼠生化指标的比较

与Control组相比，DN 组大鼠血糖、尿素氮、肌酐以及24 h尿蛋白含量明显升高（P<0.01）。与DN组大鼠相比，WBGSF各剂量组大鼠血糖、尿素氮、肌酐以及24 h尿蛋白含量明显降低（P<0.05或P<0.01）。见表1。

表1 各组大鼠血糖、尿素氮、肌酐、24 h尿蛋白含量比较（xˉ±s，n=6）

2.6 各组大鼠肾组织病理变化的比较

Control 组大鼠肾组织肾小球结构完整、清晰，肾小管上皮细胞排列整齐。DN 组大鼠肾组织肾小球肥大，系膜增生，系膜外基质增多，肾间质细胞外基质沉积明显，肾小管上皮细胞出现空泡变性。温补固肾方给药组大鼠肾组织肾小球损伤和基底膜增厚现象减轻、肾小管上皮细胞空泡变性明显减少，胶原沉积减少，肾组织结构损伤有不同程度缓解。见图6。

图6 温补固肾方对DN大鼠肾组织病理变化的影响（400×）

2.7 各组大鼠肾组织AGEs和RAGE含量的比较

与Control组相比，DN 组大鼠肾组织AGEs 和RAGE 含量显著升高（P<0.01）。与DN 组相比，WBGSF 各剂量组大鼠肾组织AGEs 和RAGE 含量显著降低（P<0.05或P<0.01）。见图7。

图7 各组大鼠肾组织AGEs和RAGE水平比较

2.8 各组大鼠肾组织AGE－RAGE 信号通路蛋白表达的比较

与Control组相比，DN组大鼠肾组织RAGE蛋白表达显著升高（P<0.01）。与DN组相比，WBGSF各剂量组大鼠肾组织RAGE蛋白表达显著降低（P<0.01）。见图8。

图8 各组大鼠肾组织AGE－RAGE信号通路蛋白表达情况比较

3 讨论

中医学称糖尿病为消渴病，伴随糖尿病病情发展会诱发DN，DN可归于“水肿、关格、肾浊”范畴，主要表现为肾虚阴阳失衡、水液潴留等［7］，阳气虚衰为其主要征象，尤其以肾阳虚为主，另伴有瘀血内阻之象［8］。因此，DN治疗多以温阳、补肾、固肾治疗为主。温补固肾方中党参具有补气健脾、扶正气之功效。山茱萸具有补益肝肾、收涩固脱之效。芡实可益肾固精，补脾止泻。菟丝子具有清热解毒、健脾利湿之效。覆盆子益肾固精、平补肝肾。淫羊藿具有温肾、壮阳之效。益智仁具有温化肾气、温补肾阳的作用。诸药合用能够发挥温阳，补肾功效。但是目前有关WBGSF 对DN 的治疗效果及其可能作用机制尚不清楚。为此，本研究首先通过网络药理学分析WBGSF 有效活性成分调控潜在靶点基因，通过何种信号通路，从而发挥治疗DN。

TCMSP 数据库筛选WBGSF 有效活性成分81 个，主要包括异鼠李素、山柰酚、木犀草素、槲皮素、菠菜甾醇和大豆黄素等。涉及潜在靶点基因260 个。以“GeneCard”“OMIM”“PharmGkb”“TTD”及“DrugBank”数据库，预测DN 相关靶点，共获得DN 相关靶点3 573 个。进一步实验通过构建“WBGSF－关键靶点－疾病”网络，明确WBGSF 治疗DN 的化合物与潜在靶点基因之间的关系。筛选结果显示，WBGSF 有效活性化合物能够通过调控AKT、MAPK、细胞凋亡以及炎症性细胞因子等基因发挥DN 治疗作用。既往研究发现，抑制Akt蛋白表达，能够降低高糖诱导的肾小管上皮细胞间质转化，减少胶原沉积，从而改善DN［9］。MAPK 是与DN 肾组织炎症反应密切相关，在DN 肾组织中p－MAPK 表达明显升高，抑制p－MAPK 能够降低炎症因子TNF－α、IL－1β 表达［10］。炎症反应包括促炎因子TNF－α、IL－1β、COX－2 等合成与释放增加，会导致DN 肾纤维化，加重肾组织结构损伤［11］。WBGSF 中的活性成分木犀草素能够通过抗氧化作用以及降低肾组织转化生长因子－β1 和纤溶酶原激活物抑制物－1 表达发挥DN 大鼠肾脏保护作用［12］。槲皮素能够通过调控p38MAPK/NF－κB 信号，减轻DN肾组织炎症［13］。山柰酚能够通过调控p38MAPK 通路，改善高糖诱导大鼠肾系膜细胞损伤［14］。本研究初步揭示WBGSF 有效活性化合物可能通过作用上述靶点基因，从而发挥DN 肾脏保护作用，表明WBGSF 治疗DN 具有多成分－多靶点的特点。GO 功能富集和KEGG 通路富集分析发现，WBGSF 能够通过调控脂质－动脉粥样硬化信号通路、AGE－RAGE 信号通路以及流体剪切应力和动脉粥样硬化通路等发挥治疗DN 的作用。研究发现，槲皮素等有效活性成分能够通过调控AGE－RAGE 信号通路，降低AGE 和RAGE水平，抑制系膜细胞增殖和降低尿蛋白水平，从而改善DN 肾损伤［15］。脂质－动脉粥样硬化信号通路与DN 损害密切相关。山柰酚具有广泛的药理学活性能够调节血脂，降低动脉粥样硬化［16］。以上研究表明WBGSF 能够通过多组分－多靶点－多通路发挥DN保护作用。

为证实WBGSF 能够治疗DN，改善DN 肾损伤。本研究首先通过构建DN 大鼠模型，观察WBGSF 对DN 的治疗作用。结果显示与DN 组相比，WBGSF 各剂量组大鼠血糖、尿素氮、肌酐以及24 h 尿蛋白含量明显降低。进一步通过HE 和Masson 染色观察肾组织形态学变化，发现与DN 组相比，WBGSF 各剂量组肾组织肾小球损伤和基底膜增厚现象减轻、肾小管上皮细胞空泡变性明显减少，肾组织结构损伤有不同程度缓解。以上研究结果表明WBGSF 具有有效治疗DN作用。

前期网络药理学筛选结果显示在WBGSF 治疗DN 众多通路中AGE－RAGE 信号通路与DN 的发病机制密切相关。AGEs 是高糖环境下的代谢产物，被称为“糖毒素”，是引起糖尿病微血管病变的重要始动环节［17］。RAGE 是介导AGEs 对心血管系统损伤的主要受体，与AGEs 结合后能够激活下游多种信号通路，包括p38MAPK、NF－κB、PI3K 信号等，共同参与DN氧化应激、炎症反应以及细胞凋亡［18］。因此，通过抑制AGEs－RAGE 信号通路激活，是预防DN 疾病进展的有效策略。本研究发现与DN 组相比，WBGSF 各剂量组大鼠肾组织AGEs 和RAGE 含量降低，RAGE 蛋白表达明显降低，表明WBGSF 能够通过抑制AGERAGE 信号通路，改善DN 肾损伤。

综上所述，本研究利用网络药理学方法探究WBGSF 对DN 的治疗作用。结果显示WBGSF 可以通过“多组分－多靶点－多通路”发挥DN 肾损伤保护。动物实验证实WBGSF 能够降低大鼠血糖、尿素氮、肌酐以及24 h 尿蛋白含量，改善DN 肾损伤，其机制与抑制AGE－RAGE信号通路相关。