稳斑汤对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化不稳定斑块自噬相关蛋白Atg5和LC3B的影响

李思琦，赵兵，张磊，肖福龙，宫丽鸿✉

（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是导致缺血性卒中、心肌梗死等动脉粥样硬化性心脑血管病的重要病理学基础［1］，它的主要病理特点是在动脉血管内壁沉积一种类似粥样的脂类物质，引起血管腔狭窄，甚至阻塞，发生供血障碍。AS 不稳定斑块具有脂质核较大、表面纤维帽薄，大量巨噬细胞为主的炎症细胞浸润等病理特征。细胞利用溶酶体途径降解过多的或已受损的细胞器和损伤蛋白的生命现象被称作自噬［2］。已有研究证明，自噬与多种心血管病紧密相关，尤其是AS 的发生和发展［3－5］。在形态学上，自噬一般分为自噬体的诱导、形成、运输、裂解等4 个阶段。起初，在缺血、缺氧或者饥饿等状态时，自噬在复杂的分子调控下被诱导；然后，自噬相关蛋白Beclin1 基因12/Atg5 和Atg8 泛素化系统参与进来，将LC3 转化为LC3Ⅱ，并与Atg12－Atg5－Atg16L 复合物结合成自噬体［6］；接着，将自噬体运送至溶酶体；最后，自噬体与溶酶体融合降解其内的废物，分解的脂肪酸、氨基酸等有用物质供机体回收再利用［7］，为细胞修复再生、某些细胞器的更新提供必需的原料，以维持细胞稳态。Atg5和LC3是自噬体形成至关重要的基因，二者都参与了对自噬活性的调控。自噬泡形成之初，由ATG12－ATG5－ATG16L形成的复合物与自噬泡外膜相结合，这种结合促进自噬泡伸展扩张［8］，同时还促使LC3向自噬泡募集。LC3是自噬体标志性基因，可作为诊断指标［9］，LC3B是LC3的亚型之一。适度自噬能抑制AS的形成与发展［10］。前期动物实验证实，搜风祛痰中药稳斑汤具有抗AS及稳定易损斑块的作用［11－12］，因此，现通过给予ApoE基因敲除小鼠稳斑汤的方法，观察Atg5 和LC3B 的蛋白表达水平，从而探讨稳斑汤影响AS斑块稳定性的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60只6周龄雄性ApoE 小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物许可证号：SCXK（京）2020－0004。20 只6 周龄雄性C57BL/6J 小鼠，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物许可证号：SCXK（辽）2020－0001。本实验符合辽宁中医药大学动物伦理委员会标准（实验动物伦理审查编号：21000042020038）。

1.2 实验药物

稳斑汤组成：全蝎5 g，蜈蚣1 条，地龙15 g，陈皮15 g，法半夏15 g，白术15 g 和水蛭15 g。上述药物均购自辽宁中医药大学附属医院中药局。首先将药物浸入常温水中0.5 h，先武火后文火煎1 h，倒出药液，煎煮3 次，将药液合并，纱布过滤，100 ℃水浴浓缩至100 mL，4 ℃冰箱储存，加工制成含生药2 g/mL 的中药浓缩液备用；阿托伐他汀片（规格：10 mg/片，辉瑞制药有限公司，批准文号：EG6187）。

1.3 实验试剂和仪器

兔抗鼠Atg5（批号：49050）、LC3B（批号：30848），Signalway Antibody公司；辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG（批号：K1223），ApexBio 公司；SDS－PAGE 电泳液（批号：P0014B）、SDS－PAGE 凝胶配制试剂盒（批号：P0012A）、SDS－PAGE 蛋白上样缓冲液（5 ×）（批号：P0015L）、Western 转膜液（批号：P0021B）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号：P0012）、RIPA 裂解液（强）（批号：P0013B）、超敏ECL 发光试剂盒（批号：P0018S），碧云天生物技术研究所。

SIS透射电镜数字摄像头（TEM CCD Camera），德国EMSIS，型号：MORADA；电泳仪（EPS200型）、凝胶成像分析系统（Tanon－4200SF型），上海天能科技有限公司。

1.4 AS模型的制备

适应性普食喂养60只ApoE基因敲除小鼠1周，然后进行高脂喂养，饲料由沈阳于洪区盛旺牧业饲料厂提供。13周后，依据随机数字表取4只处死，取腹主动脉血管，HE染色判断造模是否成功。

1.5 分组与干预方法

随机取50只造模成功的ApoE基因敲除小鼠，随机分为模型组，稳斑汤低、中、高剂量组，阿托伐他汀组，每组10 只，继续高脂饮食。随机选择10 只C57 BL/6J 小鼠为空白对照组，普食喂养。空白对照组和模型组给予生理盐水0.3 mL/d。按照成人每日临床推荐用药剂量，按成人与小鼠体表面积折算系数0.002 6 折算小鼠用量，稳斑汤各剂量组分别予稳斑汤6.175、12.35、24.7 g/（kg·d），阿托伐他汀组予阿托伐他汀片25.4 mg/（kg·d）；高剂量组为中剂量组两倍，中剂量组为低剂量组两倍。每日灌胃1次，共13周。

1.6 标本采集和处理

处死全部小鼠，剪开小鼠胸腔和腹腔，取出整条腹主动脉，清除主动脉外部脂肪，将主动脉−80 ℃冷冻保存于冰箱。

1.7 观察指标与方法

1.7.1 超微透射电镜观察自噬体

取主动脉弓，用移液枪抽取2.5%戊二醛进行固定，将组织切成长宽均为1 mm 的小块，放入盛有1 mL 4 ℃戊二醛固定液的EP 管中待用；脱水、包埋、超薄切片、染色，在透射电子显微镜下观察、拍照。

1.7.2 Western blot 法检测Atg5 和LC3B 蛋白表达水平

取冰箱中主动脉组织融化，按组织净重与裂解液1∶10的比例加入蛋白提取试剂，并用高速电动匀浆器在冰上进行匀浆，匀浆后静置于冰上20 min，10 000 r/min离心15 min，分离上清液，即为总蛋白备用。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，制备凝胶，加入等量上样缓冲液，SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将蛋白转移到PVDF 膜，封闭40 min，4 ℃孵育一抗（Atg5 稀释比例1∶1 000，LC3B稀释比例1∶500）过夜，室温孵育二抗（稀释比例1∶5 000）1 h，洗膜，ECL 发光，凝胶系统成像，使用Image J 软件计算蛋白灰度值，并用目的蛋白灰度值和内参灰度值的比值表示相应目的蛋白表达量，进行统计分析。

1.8 统计学方法

使用SPSS 21.0 版软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（）表示，多组均数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠腹主动脉组织透射电镜观察结果

空白对照组可见少量自噬体，自噬体呈双层膜囊泡状结构，其中有内容物；模型组无明显自噬体；稳斑汤各剂量组和阿托伐他汀组均观察到有较多自噬体，其数量均高于模型组；其中阿托伐他汀组自噬体最多。见图1。

图1 各组小鼠腹主动脉组织透射电镜下结构（×5 000）

2.2 各组小鼠腹主动脉组织Atg5 和LC3B 蛋白表达水平比较

各组小鼠腹主动脉组织Atg5和LC3B蛋白电泳图见图2。与空白对照组相比，模型组小鼠腹主动脉组织Atg5 和LC3B 蛋白表达水平均降低（P<0.05）；与模型组相比，稳斑汤各剂量组和阿托伐他汀组小鼠腹主动脉组织Atg5 和LC3B 蛋白表达水平均升高（P <0.05）。见表1。

图2 各组小鼠腹主动脉组织中Atg5、LC3B蛋白表达电泳图

表1 各组小鼠腹主动脉组织Atg5、LC3B蛋白表达水平比较（xˉ±s）

3 讨论

冠状动脉粥样硬化作为心肌梗死、冠心病的主要病理基础，其本质是慢性炎症［13］。由于斑块的不稳定性，AS 斑块破裂会导致急性心血管事件发生。因此，深入研究不稳定斑块易损性的机制，促使不稳定斑块向稳定趋势发展，是减少急性心血管事件发生的根本。

自噬是为保持细胞稳态、细胞器完整性的一种自我防御保护机制［14］。相关研究发现，自噬在AS中有着不容忽视的作用，自噬与AS 斑块脆弱性密切相关［15］，提高自噬水平可以抑制AS［16］，降低AS 斑块脆弱性［17］。自噬这一进程受自噬相关基因（Atg）的严格调控，其中Atg5 是自噬体形成进程的重要基因之一，哺乳动物去除Atg5 能够阻止自噬发生［18］。周仕霞等［19］研究发现，干扰Atg5 基因后，细胞自噬活性明显降低。LC3 作为真核细胞Atg8 的同源基因，存在于自噬泡前体和自噬体膜的表面，它参与了自噬体形成，是确认自噬发生的最直接证据［20］，其含量与自噬体数量呈正相关，检测亚型LC3B 的蛋白可反映自噬程度［21］。目前认为，适度自噬对AS斑块具有保护作用。

他汀类药物具有明确的稳定斑块、抗炎、抗氧化应激、改善内皮功能及抑制血栓形成等作用。阿托伐他汀片是目前临床上应用最广泛的新型他汀类药物，是调节血脂、预防AS、稳定AS 斑块的首选药物。研究显示，阿托伐他汀可通过AMPK 信号通路激活自噬抑制凋亡［22］，还可通过提高自噬，抑制巨噬细胞炎性反应，减少脂质沉积，使AS 斑块更稳定［23－24］。因此，本实验选用阿托伐他汀片为西药对照药。

本研究结果表明，在透射电镜下发现，空白对照组有少量自噬体，说明在正常生理条件下，自噬处于一个基础水平；与空白对照组比较，模型组无明显自噬体，说明自噬处于很低水平。稳斑汤各剂量组和阿托伐他汀组均有较多自噬体出现，且数量均高于模型组，说明稳斑汤和阿托伐他汀组具有提高自噬水平的效果。此外，与空白对照组相比，模型组小鼠腹主动脉组织中Atg5、LC3B 蛋白表达水平明显降低，说明AS 发生时，可导致Atg5、LC3B 蛋白表达水平的降低；而稳斑汤各剂量组和阿托伐他汀组均不同程度地提高Atg5、LC3B蛋白表达水平，说明稳斑汤和阿托伐他汀都提高了自噬相关蛋白活性。以上这些证据均说明稳斑汤可通过上调Atg5、LC3B蛋白表达水平来提高自噬活性。

AS是现代医学病名，中医典籍未对此病名进行记载，据其临床表现可将其归属于“胸痹”等范畴。老年人恣食膏粱厚味，又年老体虚，久则易损脾胃之气，使脾胃运化输布无权而酿生痰浊。痰浊日久浸渍在脉道中，或情志内伤导致气机不畅，可使血行失畅，脉络不利，内生瘀血，阻滞于心脉之中。随着病程进展，久病则损人体正气，气虚无法推动血液运行，瘀血阻滞更甚，痰浊与瘀血互结，不能排出，积聚日久致内生毒热，热极生内风。风为百病之长，且善行数变，百病皆由痰作祟，风痰内动。运用取类比象的方法，“风”之“善行数变”之性，恰恰类似AS斑块的不稳定之性。宫丽鸿教授根据多年临床经验提出“风痰”是导致AS的主要病因［25］，故以“风痰理论”为基础，创新性地化裁《医学衷中参西录》中的逐风汤，创搜风祛痰中药稳斑汤治疗以动脉粥样硬化为基础的心血管疾病，疗效显著。方中蜈蚣、全蝎、地龙三药相须，兼具搜风止痉、通络止痛之效，共为君药；陈皮、法半夏、白术三药共用为臣药，兼具燥湿健脾、理气化痰之效；水蛭为佐药，破血行瘀。纵观全方，共奏搜风祛痰、活血化瘀之功。现代药理研究显示，蜈蚣不仅具有溶栓作用，还能抑制血管内动脉血栓形成，改善心肌缺血［26］；全蝎具有抗凝、抗血栓、促纤溶的功效，并改善血液循环［27］，其所含的饱和脂肪酸具有抑制静脉血栓形成、延缓AS 进程的作用［28］；地龙具备抗凝、抗血栓的效用［29］，还能改善微循环，其所含蚓激酶有纤溶酶的活性；陈皮具有降低血脂、抗AS、保护心肌、抗炎及抗氧化的作用［30］；半夏具有抗炎、抗氧化的作用［31］，还能降低血黏度、提高红细胞变形能力；白术具有调节脂代谢、抗动脉粥样硬化的作用［32］；水蛭所含的水蛭素作为天然的凝血酶抑制剂，能抑制凝血酶与血小板结合，也具备抗凝［33］、抗血栓［34］的效用，还能调节脂代谢［35］。以上研究结果奠定了稳斑汤干预AS的现代药理学理论基础。稳斑汤基于整体观，多途径、多靶点地干预AS，为防治AS提供了新思路、新方法，具有临床推广价值。

综上所述，本研究发现稳斑汤具有提高细胞自噬活性、抗AS的作用。干预Atg5、LC3B 蛋白表达或将成为防治AS新靶点。提高Atg5、LC3B 蛋白表达水平，这可能是其增强AS斑块稳定性的分子机制之一，为更加明确稳斑汤的作用靶点，仍需继续在分子生物学、基因层面对其进行深入研究。