玉米叶片原生质体瞬时转化体系的优化

赵小慧 ，郁 凯 ，刘 冲 ，钟明娟 ，贺亭亭 ，董 静 ，王 凯 ，邢锦城 *

（1.江苏沿海地区农业科学研究所，江苏 盐城 224002；2.诸城市农业农村局，山东 诸城 262200）

玉米是全球三大主要粮食作物之一，其用途多样，不仅可以食用，也是重要的饲料、医药和工业原料。在我国，玉米是目前种植面积和产量最大的主粮作物，在国家粮食安全和国民经济发展中有着举足轻重的作用。但长期以来，由于育种家存在过度依赖和利用国外具有知识产权保护的玉米品种资源、育种设备和自身技术落后等问题，我国优质玉米品种培育远滞后于发达国家，严重制约我国玉米育种进程和产业可持续发展[1]。为改变这一现状，育种家早期利用传统的遗传育种方法育成了一批玉米品种，但其品质大多有待提高，无法完全满足生产需求。如今，随着科技的进步，通过生物技术手段对玉米进行定向遗传改良成为解决问题的关键，此技术不仅能够打破玉米的种间生殖隔离，还能创造出新的品种资源，逐渐成为玉米新品种创制的主流方法[2]。

植物原生质体是指利用一些特殊方法去除细胞壁后留下的被质膜所包围的具有细胞全能性的细胞体。无细胞壁的原生质体因质膜直接与外界接触，相对易摄取外来遗传物质，为植物的遗传转化创造了有利条件。此外，原生质体也是用作体细胞杂交、诱导体细胞无性系变异和选育突变的重要起始生物材料[3]。这些技术扩大了育种范围，为增加植物种质资源提供了更多途径。在玉米原生质体的分离方法中，通过纤维素酶和果胶酶酶解细胞壁的方法因快速、高效和经济等优势成为获得原生质体主要的技术手段。近年来，通过不断改进和优化原生质体的分离酶解法，玉米原生质体体系日臻完善，已广泛应用于各种研究[4]。

玉米原生质体瞬时表达系统具有表达快速、转化效率高、实验差异少等多重优点，被广泛用于玉米基因功能的研究[5-7]；而各种报告基因在玉米原生质体中的使用，更是进一步增加了使用该体系的便捷性和广泛性[8-10]。目前，玉米原生质体的制备已相对成熟，但使用频率较高的PEG 介导的瞬时转化法尚需要不断摸索。本文通过探索PEG 4000 浓度、转化时间和质粒用量对玉米原生质体转化效率的影响，以期获得更高效的玉米原生质体瞬时转化体系，为玉米种质创新和优良品种选育建立一条更为有效的途径。

1 材料与方法

1.1 试剂制备

本研究所用纤维素酶R-10、离析酶R-10 购自日本 Yakult，聚乙二醇（PEG 4000）、甘露醇和 BSA（牛血清白蛋白）均购自Sigma 公司；其余常规试剂均为国产分析纯。酶解液：1%纤维素酶R-10，0.1%离析酶 R-10，0.6 mol/L 甘露醇，10 mmol/L MES[2-（N- 吗啉）乙磺酸，pH 值 5.7]，55 ℃水浴 10 min 后冷却至室温，继续加入 1 mmol/L CaCl2，5 mmol/Lβ-巯基乙醇，0.1%BSA。MMg 溶液：0.6 mol/L 甘露醇，15 mmol/L MgCl2，4 mmol/L MES（pH 值 5.7）。W5 溶液：154 mmol/L NaCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl，2 mmol/L MES（pH 值 5.7）。培养液：4 mmol/L MES（pH 值 5.7），0.6 mol/L 甘露醇，4 mmol/L KCl。

1.2 试验设计

分别改变质粒用量、PEG 4000 浓度和转化时间中的一个变量，确定玉米原生质体瞬时转化的最佳体系。1）不同的PEG 4000 浓度。PEG 4000 质量浓度（以下简称浓度）分别为10%、20%、30%、40%、50%和60%，质粒用量为5 μg，转化时间为15 min。2）不同转化时间。转化时间分别为 5、10、15、20、25 min，PEG 4000 质量浓度为40%，质粒用量为7.5 μg。3）不同的质粒用量。质粒用量分别为0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 μg，PEG 4000 浓度为40%，转化时间为15 min。

1.3 方法

1.3.1 酶解法分离玉米原生质体。酶解法分离玉米原生质体参考孙悦建立的方法[6]并作适当调整。以玉米品种农大108 为材料，选取大小一致且颗粒饱满成熟的玉米种子在水中浸泡2 h，浸泡后的种子平铺在浸满水的吸水纸上，28 ℃避光催芽24 h。挑选根长2 cm 的玉米播种于混有蛭石的黑土（蛭石、黑土体积比为 1︰5）中，置于 25 ℃/23 ℃、16 h/8 h（昼/夜）的温室中培养，当玉米幼苗长到5～6 cm后移至暗处28 ℃培养。暗培养4～5 d 后切取黄化玉米平整、微外翻的第3 张叶子的6～8 cm 处，将切下来的玉米叶片均匀切细丝后完全没入盛有酶解液的培养皿中，用竹签将细丝挑拨均匀。避光在压力最高（0.1 MPa）时抽真空40～50 min，之后继续避光在水平摇床上28 ℃、40 r/min 温和摇2 h。酶解完成后将培养皿平放桌上轻轻摇1～2 min 至细丝成絮状，之后将絮状细丝挑到培养皿一边挤压使原生质体脱离。用剪口枪头吸取绿液于300 目滤网过滤，每10 mL滤液收集于15 mL 离心管中，25℃、600 r/min 水平离心3 min。小心弃上清液，加1 mL 0.6 mol/L 甘露醇重悬原生质体，25 ℃、600 r/min 水平离心3 min。小心弃上清，再次加2～6 mL MMg 重悬原生质体（重悬液根据沉淀量而定）。用血球计数板计数并稀释原生 质 体 浓 度 至 1× 105～ 2×105个细胞/mL。

1.3.2 质粒提取。植物表达载体pRTL2-eGFP 由南京农业大学陶小荣教授实验室惠赠，此载体大小约为4.5 kb，由花椰菜花叶病毒CaMV 35S 启动子、EGFP（增强绿色荧光蛋白）、CaMV 35S 终止子等元件构成。质粒参照威格拉斯生产的质粒大量提取纯化试剂盒的说明书进行提取。

1.3.3 PEG 介导的原生质体转化。分别取10 μL 不同浓度的提取质粒于2 mL 离心管中，加入100 μL 原生质体，再贴壁缓慢加入 110 μL PEG 溶液（含10%～60% PEG 4000，0.2 mol/L 甘露醇，0.1 mol/L CaCl2），上下缓慢颠倒混匀至均匀透亮，25 ℃避光水平静置5～25 min 以完成转化。分别贴壁逐滴加入440 μL W5，上下缓慢颠倒混匀，25 ℃避光水平静置 7 min 后，25 ℃、600 r/min 水平离心 3 min。小心弃上清（不必弃尽），加入200 μL 培养液，用移液器轻轻吹打混匀。最后将原生质体转移至提前用小牛血清润洗的12 孔细胞培养板，避光25 ℃培养20 h。

1.3.4 荧光观察和数据分析。将培养的原生质体600 r/min 水平离心3 min，制成3个装片用作观察。使用OLYMPUS IX71-F22FL/DIC 倒置荧光显微镜（OLYMPUS，日本）检测GFP 绿色荧光，处理荧光图像使用 ImagePro（OLYMPUS，日本）和 Adobe（San Jose，CA，美国）Photoshop 程序，每个装片拍摄 3个不同视野用以统计转化效率。数据统计分析通过GraphPad Prism 8.0 软件进行。

转化效率= 绿色发光细胞数/ 细胞总数×100%。

2 结果与分析

2.1 玉米叶片原生质体的分离

将分离的玉米原生质体在倒置荧光显微镜下观察，如图1-A 所示，呈圆球状的玉米原生质体数量较多且杂质很少，说明此方法可高效制备玉米原生质体且得到的原生质体能用于下一步的瞬时转化试验（图1-B）。

图1 激发光下质粒未转化（A）和转化（B）的原生质体图

2.2 玉米叶片原生质体瞬时转化体系优化

2.2.1 PEG 4000 浓度和转化时间对玉米原生质体瞬时转化的影响。适合的PEG 4000 浓度和转化时间对玉米原生质体的瞬时转化效率至关重要。本研究选取 PEG 4000 浓度为 10%、20%、30%、40%、50%和60%时对玉米的原生质体瞬时转化效率进行测定。如图2-A 所示，随着PEG 4000 浓度的增加，转化效率呈现先上升后下降的趋势。PEG 4000浓度为40%时转化效率显著高于其他浓度，达到最高值75.76%。此结果表明，当PEG 4000 浓度为40%时,最适合玉米原生质体的转化。

通过设置转化处理时间，测试其对玉米转化效率的影响（图2-B）。结果显示，转化时间为5 min时，转化效率较低，为35.44%；当转化时间分别增加为10、15、20 min 时，转化效率均增高且它们之间的差异无统计学意义，其中转化时间为15 min 时玉米原生质体的转化效率最高，为75.46%。当转化时间继续增加到25 min 时，转化效率反而下降至33.30%。所以转化时间选择10～20 min 时转化效率均佳，其中转化时间为15 min 时最优。

图2 PEG 4000 浓度（A）和转化时间（B）对PEG 介导的玉米原生质体瞬时转化效率的影响

2.2.2 质粒用量对玉米原生质体瞬时转化的影响。在适宜的PEG 4000 浓度和转化时间条件下，质粒用量也能够明显影响原生质体的瞬时转化效率。本研究在PEG4000 浓度为40%，转化时间为15 min 的条件下，通过在100 μL 玉米原生质体（细胞浓度为1×105～2×105个/mL）中加入不同量的pRTL2-eGFP质粒以确定转化效率最佳的质粒用量。由图3 可知，当质粒用量为2.5 μg 时，转化效率仅为18.92%。随着质粒用量的增加，转化效率迅速提升，在质粒用量为7.5 μg 时，转化效率达到峰值，为76.98%，但随着质粒用量的进一步提高，转化效率变化不再明显。从结果中发现，在上述原生质体中分别加入5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 μg 质粒时的转化效率均较高，且它们之间的差异不具统计学意义，所以本体系中 5.0～15.0 μg 的质粒用量均适合，而 7.5 μg 可作为首选。

图3 质粒用量对PEG 4000 介导的玉米原生质体瞬时转化效率的影响

3 讨论与结论

玉米是主要的农作物之一，也是单子叶植物研究的经典试验材料。国际玉米全基因组测序工作已于2009年完成，这一成果为玉米功能基因组研究提供了便利，极有利于培育更高产优质的玉米品种。然而，由于缺乏有效的遗传转化技术以产生稳定转化的玉米植株，玉米基因功能的研究异常困难。而原生质体瞬时表达系统能够快速有效地鉴定分析植物基因功能，因此，玉米原生质体的瞬时表达技术对于玉米基因功能分析至关重要。本研究在玉米原生质体制备的基础上，通过优化PEG 4000介导的玉米叶片原生质体转化条件，建立了更高效的玉米原生质体瞬时转化体系，该体系能够为后续玉米基因功能研究奠定良好的基础。

PEG 4000 浓度、转化时间和质粒用量均是影响PEG 介导的玉米原生质体转化效率的重要因素。目前，已有关于通过改变不同因素优化玉米原生质体瞬时转化体系的报道。例如，Cao 等在PEG 介导的玉米原生质体瞬时转化试验中探索出最佳的DNA与原生质体的比例为100 μg DNA 转化至2×105～3×105个原生质体细胞[11]。吕仁瑶等在优化玉米原生质体转化体系时发现，PEG4000 浓度为40%、质粒用量为25 μg 时瞬时转化效率最高，为51.28%[12]。赵苏州等在转化玉米原生质体时，用30%的PEG 4000 浓度得到了较高的转化效率[13]。在本研究中，我们发现当PEG 4000 浓度为40%、转化时间为15 min、质粒用量为 7.5 μg（对应 1×104～2×104个细胞）时，玉米叶片原生质体转化效率最高，为76.98%[13]。本研究相对系统地探索了不同因素对PEG 4000 介导的玉米原生质体瞬时转化效率的影响，确定了玉米叶片原生质体瞬时转化的最优条件，为培育优良玉米品种提供了更为有效的研究方法。