miR-9-3p对细胞脂代谢调节功能及可能机制

李斯 孙雅楠

(唐山市工人医院 1心内四科，河北 唐山 063000；2内分泌二科)

2型糖尿病(T2DM)占糖尿病发病率的90%～95%，它会显著增加慢性并发症的发病率及死亡率〔1〕，良好的血糖控制将会延缓并发症的发生。冠状动脉性心脏病是T2DM最主要的大血管并发症，T2DM患者的动脉粥样硬化发病机制相对复杂，其中包括年龄、性别等因素及一些基因的影响〔2〕。目前研究显示，动脉硬化发病机制包括脂质代谢紊乱、内皮功能障碍、慢性炎症和氧化还原平衡失衡〔3～5〕等，其中，脂代谢紊乱是T2DM患者动脉粥样硬化的关键致病因素。

microRNAs(miRs)是一类非编码的，长度为19～23个核苷酸〔6〕的短链小RNA分子。miRs通过转录后方式与靶基因3′端非编码区通过不完全碱基配对原则，调节靶基因表达〔7〕，并调整多种细胞功能。现在已经确定miRs在高等真核生物基因组中约占预测基因的1%，而高达30%的蛋白质编码基因可能受miRs调控〔8〕。此外，有研究证明miRs是细胞周期的关键调节因子，参与细胞增殖、分化、发育与凋亡过程，T2DM的发生是一个复杂的动态过程受各种miRs的影响〔9〕。研究显示〔10〕T2DM患者血浆miR-9-3p表达水平显著升高，但miR-9-3p与血脂代谢的关系未予报告。众所周知，以肝脏为主要器官的能量代谢，是最常涉及的糖脂代谢紊乱的器官，HepG2细胞系常作为研究对象，被用来检测细胞脂质代谢功能。本研究探讨miR-9-3p对HepG2细胞增殖的影响及其对HepG2细胞总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)调控作用，检测其对细胞Sirt-1蛋白表达的影响，探寻miR-9-3p对细胞调节的可能机制。

1 资料与方法

1.1细胞实验分组及方法 HepG2细胞系由中国协和医科大学基础研究所细胞中心提供。实验分为3组：正常对照组；HepG2细胞体外转染miR-9-3p-mimic为miR-9-3p mimic组；HepG2细胞体外转染miR-9-3p inhibitor为anti-miR-9-3p组。细胞培养：将复苏后的HepG2细胞的试管加入适量含有10%胎牛血清的DMEM培养液稀释成105/ml浓度移至培养瓶中，置于37%CO2培养箱内培养，次日更换培养液，倒置显微镜下观察细胞形态，待细胞生长铺满瓶壁即可传代。

1.2细胞转染 miR-9-3p mimic及miR-9-3p inhibitor转染：将配制好的miR-9-3p mimic、miR-9-3p inhibitor转染复合物各250 μl，分别加入到培养好的HepG2孔板中，再吸取Opti-MEM培养基750 μl/孔，加入到各孔中，前后轻柔摇动细胞板至混合均匀。将细胞培养板置于 37℃、5.0%CO2、饱和湿度的培养箱中培养24 h。转染6 h后吸取1 ml普通DMEM培养基(含有20%胎牛血清、无抗生素)，加入各孔。

1.3噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖 转染后的细胞分别于24、48、72 h用MTT法测定细胞增殖，将HepG2细胞种植在96孔板中，密度为每孔3×104。 随后，在96孔板的每孔中加入10 μl MTT溶液(浓度为15 mg/ml，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)，并在37℃下黑暗中孵育2 h。用酶标仪在490 nm波长处测量吸光度，结果以对照的百分比表示。

1.4细胞实时荧光定量(qRT)-聚合酶链反应(PCR) 转染实验结束后于培养箱中取出6孔板细胞，吸取1 ml磷酸盐缓冲液(PBS)加入每孔，清洗1次；吸取1 ml Trizol或RNAiso分别加入每孔，6孔板水平静置片刻，剥离细胞，使细胞脱落；吸取含有细胞的裂解液轻柔转移至1.5 ml离心管中，反复轻柔吹吸直至裂解液中无明显的细胞沉淀，于室温下静置5 min；吸取200 μl氯仿加入匀浆裂解液中，扣紧离心管盖，剧烈震荡离心管15 s，观察溶液直至充分乳化后，再于室温下静置5 min待用，4℃条件下12 000 r/min离心15 min；待离心完成，轻柔取出离心管，吸取上清液，转移至另一新的离心管中；吸取与上清液等体积的异丙醇加入离心管，上下轻柔颠倒离心管直至混合物充分混匀，于室温下静置10 min；4℃条件下，12 000 r/min离心10 min，离心结束后，小心吸取并弃去上清，吸取75%的乙醇1 ml缓慢沿管壁加入离心管，轻柔上下颠倒洗涤离心管管壁，置于离心机12 000 r/min离心5 min，取出离心管，小心吸取乙醇并弃去。于室温下干燥5 min，使乙醇完全挥发；吸取70～80 μl去RNA酶(DEPC)处理水加入离心管溶解沉淀，待miR沉淀完全溶解后，将离心管置于-80℃冰箱保存。miR-9-3p及内参miR-423-5p经cDNA的合成，RT-PCR进行扩增检测表达水平。

1.5细胞内TG、TC测量 检测HepG2细胞TG和TC的浓度采用TC检测试剂盒和TG检测试剂盒(BioVision，Inc.，Milpitas，CA，USA)根据说明书，基于磷酸甘油氧化酶/过氧化物酶反应，HepG2细胞在培养板中培养，至80%细胞呈汇合状态时加入1 ml低温PBS冲洗3次，之后加入试剂盒试剂和蒸馏水在37℃下混合6 min，冷却后通过细胞裂解，测定吸收剂的密度，计算TG及TC含量。

1.6Western印迹

1.6.1细胞总蛋白的提取 细胞转染完成后应用PBS清洗3次后应用RIPA裂解获得细胞总蛋白，应用考马斯亮蓝法测蛋白浓度，之后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电泳过后取目的蛋白条带恒流200 mA，转膜1 h。转膜完成后，将膜用TBST水洗完后，放入封闭液中，在摇床上封闭1 h。按1∶100或1∶200的比例配制一抗体与一抗稀释液，将封闭好的膜放入配好的一抗稀释液，4℃摇床过夜。按1∶1 000或1∶2 000的比例配制二抗与二抗稀释液，将膜放入配好的二抗稀释液，常温摇床上摇3 h。二抗孵育完成后，TBST洗3次，加显色液在凝胶成像系统显色，并记录实验结果。

1.6.2考马斯亮蓝法测蛋白浓度 应用分光光度计测定并计算每管蛋白的吸光度值，制作出标准曲线。吸取3 μl待测蛋白液，加入100 μl考马斯亮蓝显色液，用分光光度计测定并计算出吸光度值，计算出待测蛋白的浓度。

1.6.3电泳分离蛋白分子，转膜，将膜放入封闭液中，在摇床上封闭1 h。加一抗，4℃摇床过夜。加二抗，常温摇床上摇3 h。二抗孵育完成后，TBST洗3次，加显色液在凝胶成像系统显色，并记录实验结果。

1.7统计学分析 采用SPSS16.0软件进行独立样本t检验、方差分析。

2 结 果

2.1各组HepG2细胞中miR-9-3p表达水平比较 miR-9-3p mimic组HepG2细胞中miR-9-3p 表达水平(19.19±0.50)显著高于正常对照组(0.95±0.10，P<0.05)；anti-miR-9-3p组HepG2细胞中miR-9-3p 表达水平(0.13±0.03)显著低于正常对照组(P<0.05)。

2.2miR-9-3p mimic及anti-miR-9-3p对HepG2细胞增殖的影响 HepG2细胞经miR-9-3p mimic及miR-9-3p inhibitor转染后24 h、48 h、72 h，与正常对照组相比，miR-9-3p mimic组显著增加HepG2细胞增殖，anti-miR-9-3p组显著抑制HepG2细胞增殖(均P<0.05)。见表1。

表1 miR-9-3p mimic及对HepG2细胞增殖的影响

2.3各组TG、TC表达水平比较 与正常对照组相比，miR-9-3p mimic组显著增加HepG2细胞TG及TC表达；anti-miR-9-3p组显著抑制HepG2细胞TG及TC表达(P<0.05)。见表2。

表2 miR-9-3p mimic转染及miR-9-3p inhibitor转染对HepG2细胞TG、TC表达水平的影响

2.4各组Sirt-1蛋白表达水平比较 与正常对照组(0.623±0.044)相比，miR-9-3p mimic组显著降低HepG2细胞Sirt-1蛋白表达(0.174±0.013)，anti-miR-9-3p组显著增加HepG2细胞Sirt-1蛋白表达(1.250±0.069，均P<0.05)。见图1。

图1 各组Sirt-1蛋白表达水平比较

3 讨 论

miRs是一类非编码的小RNA，它们通过调节靶基因的表达发挥作用〔8〕。研究表明miRs通过调控靶向基因表达，调整细胞周期、影响细胞分化等作用在细胞增殖和凋亡中起关键作用〔11，12〕。因此，miRs在参与细胞一些生理和病理过程中发挥重要作用，目前研究显示，miRs在胰岛素信号传导和胰岛素分泌中发挥重要的作用，但真正机制尚未完全阐明〔13〕。既往基于HepG2细胞系研究表明miR-145过表达能够抑制葡萄糖摄取，降低蛋白激酶B与胰岛素受体底物-1结合，诱导胰岛素抵抗〔14〕。另一项研究显示，miR-375基因敲除小鼠胰岛β细胞的分泌功能显著降低，并导致胰岛素抵抗和血糖升高〔15〕，而过度表达miR-29a和miR-29b可能抑制胰岛素诱导的胰岛素葡萄糖摄取〔16〕。研究显示，miR不仅直接调节胰岛素分泌，调节胰腺发育和胰岛细胞分化，同时也间接调节脂质代谢〔17〕。因此，本研究进一步探索了miR-9-3p是否参与HepG2细胞脂质代谢过程。

人类miR-9基因位于15号染色体上，包括miR-9-3p和miR-9-5p，其中miR-9-3p是一类脑源性，在神经系统中高度表达，在果蝇和脊椎动物等不同物种间稳定表达，表现出100%的相似性〔18〕。miR-9研究表明，其对缺氧缺血性脑损伤后的髓鞘修复发挥重要作用〔19〕。还有研究表明，miR-9-3p在胰岛β细胞中的表达参与葡萄糖代谢过程中胰岛素分泌的生理过程。研究表明，miR-9-3p的过度表达增加了胰岛素细胞颗粒素的蛋白表达水平，并降低了胰岛β细胞的分泌功能〔20，21〕。有研究还证实，血浆中miR-9-3p可能参与胆固醇代谢和血管生成，并调节心肌的生物功能〔22〕。但miR-9-3p是否参与HepG2细胞脂质代谢有待阐明。本研究结果表明，miR-9-3p可能是一种潜在的脂质代谢相关疾病的治疗靶点。

为了研究miR-9-3p对HepG2细胞增殖的可能机制及对脂质调节的可能机制，本研究进一步评价miR-9-3p对HepG2细胞Sirt-1蛋白的表达影响。目前报道表明，Sirt-1依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)+去乙酰化酶，与细胞衰老、增殖及能量代谢的调节有关〔23〕。Sirt-1功能研究报道，Sirt-1不仅发挥抗氧化、抗凋亡和抗炎作用，并能抑制糖对细胞的发育不良影响，改善肝脏、肌肉和脂肪组织的胰岛素敏感性〔24～26〕。此外，激活和上调Sirt-1可能减退年龄相关疾病如神经退行性疾病，同样的，在胰岛素抵抗受试者其Sirt-1表达下调〔27〕。在肝组织中，Sirt-1能够调节脂质代谢平衡。Lovis等〔28〕发现肝脏中的Sirt-1基因敲除，降低胰岛素敏感性并上调游离脂肪酸和胆固醇。此外，Adlakha等〔29〕发现HepG2细胞中miR-128通过靶向Sirt-1的表达来调节脂质代谢。这些发现表明Sirt-1的表达能够调节脂质代谢。因此，刺激Sirt-1表达上调可能是调节血脂疾病的可能途径之一。

综上，抑制miR-9-3p表达具有抑制HepG2细胞增殖，降低HepG2细胞TC和TG含量，增加HepG2细胞Sirt1蛋白表达的作用。可能有助于帮助理解miR-9-3p在T2DM相关动脉硬化并发症发生中的可能作用，并且miR-9-3p可能作为一种新型的治疗目标，用于治疗T2DM患者脂代谢紊乱的调节中。