单唾液酸四己糖神经节苷脂对DPN大鼠多元醇代谢通路及尾神经电生理变化的影响

任丽敏 何红丽 白玲茹 赵霞

(1南阳医学高等专科学校，河南 南阳 473000；2南阳医学高等专科学校第一附属医院门诊部)

糖尿病周围神经病变(DPN)是糖尿病常见并发症，临床症状以感觉丧失、肌肉萎缩、疼痛等为主，可累及运动、感觉及自主神经，引发坐骨神经结构及细胞受损，造成患者疼痛和神经功能障碍，极大影响其正常工作生活〔1，2〕。糖尿病(DM)体内高糖环境可引发严重的炎症反应，造成坐骨神经轴突变性萎缩、髓鞘紊乱、神经细胞凋亡，在DPN的病理过程中具有关键作用〔3〕；另外高糖还可激活多元醇代谢通路，使神经细胞内多元醇含量明显增加，造成渗透性肿胀，破坏细胞结构完整性，并可促进氧自由基生成，加重炎症反应，也是DPN重要发病机制之一〔4〕。研究发现，单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM)1可减轻DPN患者神经炎症，缓解疼痛，改善其临床症状，具有神经保护作用〔5，6〕，本研究探索GM1对DPN大鼠多元醇代谢通路及尾神经电生理变化的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 清洁级雄性SD大鼠：上海茂生衍生物科技有限公司，生产许可证号SCXK(沪)2017-0004，体重180～220 g，饲养在南阳医学高等专科学校第一附属医院动物房中，室内环境安静、通风良好，维持清洁级，温度25℃，相对湿度55%，自然照明。

1.1.2主要试剂及仪器 GM1钠(长春翔通药业有限公司，国药准字H20066833)；甲钴胺(北京星昊医药股份有限公司，国药准字H20060865)；链脲佐菌素(西安热默尔生物科技有限公司，货号0210055701)；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(上海信帆生物科技有限公司，货号G1120-10)；大鼠醛糖还原酶酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海圻明生物科技有限公司，货号YS06433B)；大鼠山梨醇ELISA试剂盒(上海江莱生物科技有限公司，货号LCS34521)；大鼠白细胞介素(IL)-6 ELISA试剂盒、大鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α ELISA试剂盒、果糖测定试剂盒(美国Abcam公司，货号ab100772、ab5603、ab83380)；RIPA裂解液、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(上海碧云天公司，货号：P0013K、P0011)等。XElx800酶标仪(Perkin Elmer公司，美国)；BIO-EVF3 Von Frey探针(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，中国)；ZH-YLS-6B智能热板仪(上海珂淮仪器有限公司，中国)；RM2016病理切片机(购自上海徕卡仪器有限公司，中国)；ECLIPSE CI正置光学显微镜(NIKON公司，日本)；肌电诱发电位仪(大化集团有限责任公司，中国)等。

1.2方法

1.2.1动物模型制备及分组给药 参考文献〔7〕中的方法制备DPN大鼠模型：尾静脉注射55 mg/kg剂量的链脲佐菌素溶液，72 h后测量血糖，至少连续2次结果均高于16.7 mmol/L，提示DM大鼠模型建立成功，28 d后以不同标号的Von Frey探针刺激安静状态下大鼠右侧后爪皮肤，记录大鼠嘶吼或缩爪任一行为时Von Frey探针的克数，即缩爪阈值，重复测试5次，中间间隔5 min，取平均值，当其明显降低时，表明DPN大鼠造模成功。共建模64只，成功60只，随机分为5组：模型组、GM1低剂量组、GM1中剂量组、GM1高剂量组、甲钴胺组，每组12只，另取12只SD大鼠，腹腔注射等剂量生理盐水，设定为对照组。

将GM1〔8〕溶于生理盐水，GM1各剂量组以1.0、2.5、5.0 mg/kg的剂量尾静脉注射，同时以与甲钴胺组相同的剂量灌胃生理盐水；将甲钴胺〔9〕溶于生理盐水，甲钴胺组以0.25 mg/kg的剂量灌胃，同时以与GM1高剂量组相同的剂量尾静脉注射生理盐水；对照组与模型组以与甲钴胺组相同的剂量灌胃生理盐水，同时以与GM1高剂量组相同的剂量尾静脉注射生理盐水，1次/d，持续14 d。

1.2.2大鼠疼痛检测试验 结束给药后24 h，进行机械性疼痛刺激试验，检测缩爪阈值；热敏试验：将安静的大鼠放置在温度保持在(44±1)℃的智能热板仪热板上，记录大鼠出现后肢撤回或嘶吼时所用的时间，即为热敏潜伏期，重复测试5次，中间间隔25 min，取平均值。

1.2.3大鼠尾神经电生理变化检测 疼痛检测试验结束后，以肌电诱发电位仪测定大鼠尾神经电生理指标：尾神经根部远端放置刺激电极的阴极，近端放置阳极，相距1 cm，参考电极置于尾尖远端，相距记录电极1 cm，记录电极置于尾尖近端，相距刺激电极阴极14 cm，接地电极置于刺激电极与记录电极之间，在3～6 mA范围内逐渐增加刺激强度，使记录到的神经动作电位达到最大值，测定运动神经传导速度、波幅；将记录电极与刺激电极互换，刺激强度固定于1.2 mA，测定感觉神经传导速度、波幅。

1.2.4大鼠坐骨神经病理变化情况检测及标本收集 电生理检测结束后，使用5 ml注射器经尾静脉取血3 ml，静置10 min，3 000 r/min，4℃，离心15 min，收集上清，获得血清，储存在-80℃冰箱备用；大鼠吸入乙醚麻醉，断头处死，解剖分离右侧后肢坐骨神经组织，取0.5 g剪碎，加入1 ml RIPA裂解液，匀浆，3 000 r/min，4℃，离心20 min，收集上清，获得蛋白样品液，采用BCA法测量总蛋白浓度后，-80℃储存备用；剩余坐骨神经组织以4%多聚甲醛溶液固定、低浓度到高浓度的梯度酒精溶液脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后，采用切片机做厚度为2 μm的连续病理切片，经脱蜡、高浓度到低浓度梯度酒精溶液浸泡处理后，做HE染色，参照试剂盒说明书进行，再次进行脱水、透明处理，最后封片，使用光学显微镜观察坐骨神经病理变化，任选5个视野拍照。

1.2.5大鼠坐骨神经醛糖还原酶活性、多元醇(山梨醇、果糖)含量和血清IL-6、TNF-α水平检测 取出1.2.4中的蛋白样品液和血清，置于冰水浴中解冻，以各自试剂盒检测其中醛糖还原酶活性、多元醇(山梨醇、果糖)含量、IL-6、TNF-α水平，具体步骤参照说明书进行。

1.3统计学方法 采用SPSS24.0软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组机械性痛觉刺激及热敏刺激测定结果 与对照组比较，模型组缩爪阈值及热敏潜伏期明显降低(P<0.05)。与模型组比较，GM1低、中、高剂量组及甲钴胺组缩爪阈值及热敏潜伏期升高，且GM1各组呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)，GM1高剂量组与甲钴胺组差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组缩爪阈值及热敏潜伏期

2.2各组尾神经电生理变化 与对照组比较，模型组运动及感觉神经传导速度、波幅均显著降低(P<0.05)。与模型组比较，GM1低、中、高剂量组及甲钴胺组运动及感觉神经传导速度、波幅均明显升高，且GM1各组呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)，GM1高剂量组与甲钴胺组差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组尾神经电生理变化

2.3各组坐骨神经病理形态变化 对照组神经纤维排列紧密，结构正常。模型组神经纤维结构混乱，排列松散分离，出现明显的病理损伤。与模型组比较，GM1低、中、高剂量组及甲钴胺组神经纤维病理损伤减轻，且神经纤维组织结构随GM1剂量升高而逐渐恢复正常，GM1高剂量组与甲钴胺组比较，神经纤维病理损伤无明显差异，见图1。

图1 各组坐骨神经病理(HE染色，×200)

2.4各组坐骨神经醛糖还原酶活性 与对照组比较，模型组坐骨神经醛糖还原酶活性显著升高(P<0.05)。与模型组比较，GM1低、中、高剂量组及甲钴胺组坐骨神经醛糖还原酶活性明显降低，且GM1各组呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)，GM1高剂量组与甲钴胺组差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.5各组坐骨神经多元醇(山梨醇、果糖)含量 与对照组比较，模型组坐骨神经山梨醇、果糖含量显著升高(P<0.05)。与模型组相比，GM1低、中、高剂量组及甲钴胺组坐骨神经山梨醇、果糖含量明显降低，且GM1各组呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)，GM1高剂量组与甲钴胺组差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.6各组血清TNF-α、IL-6水平 与对照组比较，模型组血清TNF-α、IL-6水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较，GM1低、中、高剂量组及甲钴胺组血清TNF-α、IL-6水平含量明显降低，且GM1各组呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)，GM1高剂量组与甲钴胺组差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 各组坐骨神经醛糖还原酶活性、山梨醇、果糖含量及血清TNF-α、IL-6水平

3 讨 论

DPN是DM患者的一种慢性并发症，可导致其肢体麻木、疼痛、感觉减退，严重时可致残，甚至致死〔10〕。DPN病程进展缓慢，发病机制复杂，与氧的亲和力强的糖化血红蛋白增多，引发血氧降低，造成组织细胞长期缺氧是DPN患者发生神经病变的病理基础〔11，12〕。神经电生理检查运动及感觉神经传导情况，在DPN基础及临床研究中得到了广泛应用，是判定DPN治疗效果的经典检测方法〔13〕。本文结果表明链脲佐菌素诱导的高血糖可损害大鼠坐骨神经组织，造成运动及感觉神经传导受损，并引发疼痛，提示模型建立成功。

大多研究认为DPN的发病与多元醇通路激活、糖基化产物产生、微血管病变、炎症反应、氧化应激等诸多因素有关。醛糖还原酶是多元醇代谢通路中的第一个酶，激活该酶，可促使葡萄糖大量转化为山梨醇，并进一步转化为果糖，积累在神经细胞内，导致产生高渗状态，造成细胞肿胀、破裂〔14，15〕，另外高糖可诱导氧自由基过量产生，促进炎性因子表达，引发严重的炎症反应，最终加重神经组织损伤〔16～18〕。研究发现，GM1是治疗DPN的常用药物，可降低患者炎性因子水平，抑制炎症发生发展，缓解患者感觉异常及疼痛，改善神经传导速度，但其对多元醇代谢通路的影响目前还未见明确阐述〔19，20〕。本文结果表明，GM1可降低炎性因子表达，抑制多元醇代谢通路，减轻炎症，缓解坐骨神经病理损伤，改善神经传导障碍及疼痛，进一步证明了GM1对DPN的临床疗效。

综上，GM1可降低DPN大鼠促炎因子水平，阻止炎症发生及进展，减轻坐骨神经组织炎症损伤，缓解疼痛，改善坐骨神经运动和感觉传导功能，抑制多元醇代谢通路可能是其药理机制之一，但未对调控多元醇代谢的分子信号进行探讨，需进行后续深入探究。