lncCASC2通过miR-222-3p/CDK19轴调控胃癌NK细胞杀伤敏感性①

郭伟胜 付利然 赵 林 魏光亚 张 娟

（河南省中医院，河南中医药大学第二附属医院普外二区，郑州 450000）

胃癌是世界范围内常见疾病，是癌症死亡的第二大常见原因，全世界每年约有100 万新增胃癌病例［1］。目前胃癌在外科手术、放射治疗、化疗和新辅助治疗方面取得了巨大进展，早期胃癌患者五年生存率可达到90%以上，但由于早期确诊率较低，多数患者为晚期胃癌［2-3］。因此，寻找胃癌发生发展中的生物标志物，对胃癌诊断和治疗具有重要意义。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在发育和基因表达中发挥精确调控功能，参与X 染色体沉默、表观遗传学修饰、转录激活/干扰、核内运输等多种细胞调控过程［4-6］。近年越来越多研究表明，lncRNA 在肿瘤进展中通过转录调控基因表达，参与调节肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、转移、上皮-间质转化等过程［7］。如乳腺癌中lncRNA HOTAIR 通过miR-20a-5p/HMGA2 轴调控肿瘤细胞凋亡与侵袭［8］；lncRNA-MEG3 通过p53 信号通路抑制胃癌增殖和转移［9］。细胞周期蛋白依赖性激酶19（cyclindependent kinase 19，CDK19）的基因产物属于细胞周期蛋白依赖性激酶家族成员，是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞周期和转录的关键调控因子，具有调控细胞周期、启动DNA 合成及调控细胞转录等功能，在细胞增殖、分化中发挥重要作用，其功能失调常引起基因异常表达，与胃癌、乳腺癌、前列腺癌、急性粒细胞白血病等恶性肿瘤发生、发展及预后相关［10-11］。头颈部鳞状细胞癌中，CDK19 高表达与肿瘤局部复发、淋巴结转移、远端转移及总生存期明显缩短相关［12］。CDK19 的核表达在前列腺癌转移性肿瘤进展过程中增加，TCGA 表达数据聚类分析发现前列腺癌中CDK19 高表达与侵袭性增强和总生存期缩短有关［13］。但目前关于CDK19 在胃癌发生、发展过程的作用知之甚少，故本文将研究CDK19在胃癌中的功能。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃正常黏膜上皮细胞GSE-1（CRL-1658）购自ATCC；人胃癌细胞系SGC-7901（CL-0206）、MGC-803（CL-0158）、NCI-N87（CL-0169）购自Procell 公司；RPMI1640 培养基购自凯基生物技术股份有限公司；胰酶购自生工生物工程（上海）股份有限公司；胎牛血清购自Hyclone 公司；总RNA 提取试剂、Prime script RT、qPCR 试剂均购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；qPCR 引物由擎科生物技术有限公司合成；CCK-8 试剂盒购自索莱宝生物科技有限公司；Cytotoxicity Detection KitPLUS（LDH）购自Merck 公司；细胞凋亡检测试剂盒（FITC-Annexin ⅤApoptosis Detection kit Ⅱ）购自BD 公司；载体构建及病毒包被由汉恒生物科技有限公司负责；Lipo‐fectamine2000 购自日本TaKaRa 公司；一抗GAPDH（ab8245）、CDK19（ab168633）均购自Abcam 公司；羊抗鼠IgG 二抗和羊抗兔IgG 二抗均购自CST 公司；ECL试剂盒购自美国Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 LDH 法测定NK 细胞杀伤敏感性 效应细胞为健康志愿者外周血单个核细胞中分离的NK 细胞，Control、sh-NC、sh-CDK19 组细胞为靶细胞，设置效靶比为20∶1。收集相应组别细胞，加样至反应板，吹打均匀，500 g 室温离心3 min，使效靶细胞混匀；6 h 后检测NK 细胞对靶细胞的杀伤作用。基于比色法的LDH测定法计算杀伤率，酶标仪检测450 nm处吸光度（A），根据说明书计算细胞活性。

1.2.2 细胞转染 细胞传代生长12 h 后，胰酶消化、计数，1×104个/孔接种于12孔板，贴壁培养24 h，采用Lipofectamine2000 试剂分别转染pcDNA-Con‐trol、pcDNA-CDK19、miR-222-3p inhibitor、sh-CDK19等至靶细胞，转染48 h 后荧光显微镜观察转染效果，qPCR和Western blot检测各组细胞转染效率。

1.2.3 qPCR 检测目的基因mRNA 表达 TRIzol 法提取细胞总RNA，2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 完整性，Nanodrop3000 测定RNA 浓度与纯度，1 µg RNA 被逆转录为cDNA，逆转录产物稀释3倍，qPCR反应体系（20 µl）为：2 µl 稀释后的逆转录产物、10 µl SYBR Green Mix、正反向引物（10 µmol/L）各0.4µl、7.2µl ddH2O。95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，40个循环后终延伸完成PCR。2−ΔΔCt法计算目的基因表达。以ACTB、U6为内参，引物序列见表1，实验独立重复3次。

表1 qPCR引物Tab.1 Primer sequences of qPCR

1.2.4 Western blot 检测蛋白表达 收集目的组别细胞，预冷PBS 洗涤，胰酶消化3 min，置于新的EP管，800 g 离心4 min，弃上清，PBS 洗涤2 次，加入全细胞裂解液冰上裂解10 min，4 ℃、14 000 r/min 离心10 min，收集细胞总蛋白，BCA 显色法测定蛋白浓度。每组样品取40µg 蛋白进行SDS-PAGE，湿转法转至PVDF 膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，次日PBST洗涤3次，加入二抗室温孵育2 h，PBST洗涤，加入ECL化学发光液显影。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 取对数生长期胃癌MGC-803、NCI-N87 细胞，1×105个/孔接种于6 孔板，培养12 h，分别转染sh-NC、sh-CDK19，培养24 h，胰酶消化，预冷PBS 洗涤2 次，800 g 离心5 min，加入200µl Annexin Ⅴbinding 缓冲液重悬细胞，加入5 µl Annexin Ⅴ-FITC 混匀，避光孵育15 min，加入5 µl PI 混匀避光孵育5 min，上机检测细胞凋亡。单染的PI和Annexin Ⅴ-FITC调节补偿。

1.2.6 CCK-8 检测细胞增殖 严格参照CCK-8 实验手册将各组细胞以2 000 个/孔接种于96 孔板，90 µl/孔，设置6 个平行孔作为重复。0 h、24 h、48 h、72 h 时，10 µl/孔添加CCK-8 溶液，37 ℃孵育2 h，酶标仪检测450 nm处吸光度。

1.2.7 双荧光素酶报告基因检测 靶细胞转染嵌合荧光素酶报告基因质粒，预冷PBS洗涤，裂解缓冲液裂解，13 000 g 离心5 min，收集上清，按照制造商说明进行双荧光素酶测定。转染效率通过海肾荧光素酶的共表达进行标准化。

1.3 统计学处理 采用SPSS20.0软件进行数据分析，GraphPad 7.0 软件制图。所有实验独立重复3 次，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CDK19在胃癌组织及细胞系中高表达 TCGA数据库分析结果显示，与癌旁正常组织相比，CDK19在胃癌组织中显著高表达（P<0.01，图1A）。胃癌患者总生存期结果显示，CDK19 低表达组患者总生存周期更长（P=0.035，图1B）。GEO 数据库分析GSE26889、GSE13911 结果显示，与癌旁正常组织相比，胃癌组织中CDK19 呈显著高表达（P<0.000 1，图1C）。qPCR 结果显示，胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803、NCI-N87 中CDK19 表达显著高于正常人胃上皮细胞GES-1（图1D）。Western blot 结果显示，胃癌细胞系中CDK19 蛋白表达显著高于正常胃上皮细胞（图1E）。GEPIA2 数据库分析发现，与胃癌一致，CDK19 在胆管癌、弥漫性大B 细胞淋巴瘤、肾透明细胞癌、急性髓细胞样白血病、脑低级别胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、胸腺癌中异常高表达，而在宫颈鳞癌和腺癌、肾嫌色细胞癌、卵巢浆液性囊腺瘤、睾丸癌中异常低表达（图1F）。提示CDK19在胃癌患者及细胞系中异常高表达，且低表达CDK19的胃癌患者生存期更长。

图1 CDK19在胃癌组织及细胞系中高表达Fig.1 CDK19 is overexpressed in gastric cancer tissues and cell lines

2.2 下调CDK19 表达对胃癌细胞增殖、凋亡和NK细胞杀伤敏感性的影响 CCK-8 结果显示，胃癌细胞系MGC-803、NCI-N87 中下调CDK19 表达可显著抑制细胞增殖（P<0.01，P<0.01，图2A）。流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示，胃癌细胞系MGC-803 和NCI-N87中下调CDK19表达显著提高细胞凋亡水平（图2B）。NK 细胞杀伤能力检测结果显示，CDK19表达下调显著提高NK细胞对胃癌细胞系MGC-803、NCI-N87 的杀伤能力（P<0.05，P<0.01，图2C）。表明下调CDK19 表达可促进MGC803、NCI-N87 细胞凋亡，抑制细胞增殖，提高NK 细胞对胃癌细胞的杀伤能力。

图2 下调CDK19 表达对胃癌细胞增殖、凋亡和NK 细胞杀伤敏感性的影响Fig.2 Effects of down-regulating CDK19 on prolifera⁃tion，apoptosis and NK cell killing sensitivity of gastric cancer cells

2.3 CDK19 通过IL-6、IL-8 调控NK 细胞杀伤敏感性 抗体CHIP 分析结果显示，NCI-N87 细胞中敲低CDK19 后，IL-6、IL-8 表达显著下降（图3A）。qPCR结果显示，敲低CDK19 后NCI-N87 细胞IL-6、IL-8 mRNA 水平显著降低（P<0.001，P<0.01，图3B）。NK细胞杀伤能力检测显示，IL-8作用于MGC-803细胞后NK细胞杀伤敏感性降低，IL-6和IL-8同时作用NK 细胞后杀伤敏感性进一步下调，同样在NCI-N87细胞中加入IL-6、IL-8 均可下调NK 细胞杀伤敏感性，IL-6 和IL-8 同时作用可进一步下调NK 细胞对NCI-N87 的杀伤敏感性（图3C）。进一步分别在MGC-803 和NCI-N87 细胞中加入anti-IL-6、anti-IL-8或anti-IL-6+anti-IL-8，NK 细胞杀伤敏感性显著提高，同时加入anti-IL-6 和anti-IL-8 时NK 细胞杀伤敏感性大幅度提高（图3D）。胃癌细胞系MGC-803 和NCI-N87 中sh-CDK19 组NK 细胞杀伤敏感性显著高于sh-NC 组，当加入IL-6、IL-8 或同时加入两者均明显下调Sh-CDK19组NK细胞杀伤敏感性（图3E），表明在胃癌细胞中下调CDK19表达可抑制IL-6和IL-8表达，IL-6 和IL-8 可降低NK 细胞对MGC-803 和NCI-N87 细胞的杀伤敏感性，anti-IL-6 和anti-IL-8 可增强NK 细胞对MGC-803 和NCI-N87 细胞的杀伤敏感性。

图3 CDK19通过IL-6、IL-8调控NK细胞杀伤敏感性Fig.3 CDK19 regulates NK cell killing sensitivity through IL-6 and IL-8

2.4 CASC2 在NCI-N87 细胞中通过miR-222-3p 调控CDK19 表达 RT-PCR 结果显示，胃癌细胞系NCI-N87 中，sh-CASC2 组miR-18a-5p mRNA 水平与sh-NC组无差异，而CDK19 mRNA水平显著低于sh-NC组（P<0.01，图4A）。Western blot 结果显示，相比于WT组和sh-NC组，sh-CASC2组NCI-N87细胞CDK19蛋白表达显著降低（图4B）。RT-PCR 结果显示，在NCI-N87 细胞中敲低CASC2，miR-222-3p 水平显著提高（P<0.001，图4C），miR-222-3p inhibitor 组比对照组有更高的CDK19蛋白及mRNA 表达（P<0.001，图4D）。双荧光素酶报告实验结果显示，相比于对照组，miR-222-3p inhibitor 组细胞CDK19 基因表达显著降低（P<0.01，图4E）。表明在胃癌细胞NCI-N87 中敲低CASC2 可显著下调CDK19 mRNA及蛋白表达，上调miR-222-3p表达；敲低miR-222-3p可明显上调CDK19 蛋白及mRNA 水平，且直接调控CDK19基因转录。

图4 CASC2 在NCI-N87 细胞中通过miR-222-3p 调控CDK19表达Fig.4 CASC2 regulates CDK19 expression through miR-222-3p in NCI-N87 cells

2.5 CDK19 对NK 细胞杀伤敏感性的影响受CASC2 和miR-222-3p 调控 NK 细胞杀伤敏感性实验结果显示，以胃癌细胞系NCI-N87为研究对象，相对于sh-NC 组，sh-CASC2 组NK 细胞杀伤敏感性显著增强，而sh-CASC2+OE CDK19 组NK 细胞杀伤敏感性低于sh-CASC2 组，与sh-NC 组差异无统计学意义（图5A）。同时，miR-222-3p inhibitor 组NK 细胞杀伤敏感性较对照组显著降低，miR-222-3p inhibi‐tor+shCDK19组NK细胞杀伤敏感性高于miR-222-3p inhibitor组，但与对照组差异无统计学意义（图5B）。表明敲低CASC2 可增强NCI-N87 细胞的NK 细胞杀伤敏感性，在此基础上过表达CDK19 则抑制该效应，抑制miR-222-3p 可降低NCI-N87 细胞的NK 细胞杀伤敏感性，而抑制miR-222-3p 同时过表达CDK19则NK细胞杀伤敏感性无变化。

图5 CDK19 对NK 细胞杀伤敏感性的影响受CASC2 和miR-222-3p调控Fig.5 Effect of CDK19 on NK cell killing sensitivity is regulated by CASC2 and miR-222-3p

3 讨论

胃癌是一种高发病率和高病死率的恶性肿瘤，目前仍是全球癌症死亡的第二大原因［14］。由于胃癌早期症状不明显，多数患者发现时已是晚期，因此新的生物标志物研究对降低胃癌发病率和致死率十分关键。细胞周期蛋白依赖激酶（cyclin depen‐dent kinases，CDKs）是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞周期和转录的关键调控因子［15］。CDK19已被证明通过调节转录因子磷酸化、活性和翻转从而影响细胞稳态发育［16-17］。越来越多的研究表明，CDK19 在肿瘤中也发挥关键作用，在头颈部鳞状细胞癌研究中发现，与原发性肿瘤相比，CDK19 在局部复发和远处转移的肿瘤组织中高表达，且高表达CDK19 的原发性肿瘤患者无病生存期明显缩短［12］。CDK19 在前列腺癌中过表达与肿瘤侵袭相关［13］。通过对肿瘤组织的免疫组化检测发现，CDK19 蛋白核易位在肿瘤转移进程中增加，且通过TCGA 表达数据分析发现，CDK19 高表达与侵袭性增强、无病生存期缩短高度相关。体外实验表明，通过敲低CDK19 或采用CDK19 抑制剂治疗可显著抑制肿瘤迁移和凋亡。本研究表明，CDK19 在胃癌患者及细胞系中异常高表达，与既往研究结论一致，高表达CDK19 的患者总生存期显著缩短。细胞增殖实验表明，在胃癌细胞系MGC-803 和NCI-N87 中敲低CDK19 可显著抑制肿瘤细胞生长；凋亡分析发现，敲低CDK19 亦可促进肿瘤细胞凋亡。表明CDK19高表达促进肿瘤细胞增殖，抑制细胞凋亡，在胃癌进程中发挥关键作用。

NK 细胞在宿主抵抗感染和肿瘤免疫中起重要作用。多种细胞外部受体和内部信号参与NK 细胞对肿瘤细胞的杀伤功能。介体复合体的细胞周期蛋白依赖激酶CDK19被认为参与NK 细胞介导的肿瘤免疫过程。研究表明，SMAC 模拟物BI-8382 增加了NK 细胞数，且与CDK19抑制剂BI-1347联用可大幅增强NK 细胞毒性，从而在小鼠EMT6乳腺癌模型中产生强烈的协同抗肿瘤作用［18］。研究发现，肿瘤相关单核/巨噬细胞通过TGF-β1 损害NK 细胞的效应器功能［19］。本研究发现，CDK19 高表达抑制了NK 细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，在MGC-803 和NCI-N87 细胞中敲低CDK19 可显著增强NK 细胞杀伤敏感性。食管鳞癌研究发现，肿瘤细胞分泌的IL-6和IL-8通过STAT3途径损害了NK细胞功能［20］。本研究发现，在NCI-N87 细胞中敲低CDK19 可显著抑制IL-6 和IL-8 表达，进一步研究发现，IL-6 和IL-8可明显抑制MGC-803 和NCI-N87 细胞的NK 细胞杀伤敏感性，而IL-6 抗体和IL-8 抗体可有效增强MGC-803、NCI-N87 的NK 细胞杀伤敏感性。表明在胃癌细胞中，CDK19 高表达增强了IL-6、IL-8 表达，进而损伤NK细胞的肿瘤杀伤能力。lncRNA一般通过miRNA间接参与肿瘤发展进程，通过对CDK19上游分析发现，lncRNA CASC2 通过调节miR‐18a‐5p/CDK19促进乳腺癌紫杉醇耐药，下调CDK19表达在异种移植MCF-7/PTX 细胞小鼠中抑制肿瘤生长［21］。本研究发现，在NCI-N87 细胞中敲低CASC2 后，CDK19 mRNA 及蛋白表达明显下降，但miR-18-5p表达差异无统计学意义。本课题组通过miRDB 网站预测了与CDK19相互作用的miRNA，选取评分最高的9 个miRNA 进行检测，发现敲低CASC2 后，miR-222-3p 表达显著升高，当在NCI-N87细胞中敲低miR-222-3p 后，CDK19 mRNA 及蛋白表达显著提高。双荧光素酶报告检测证实了miR-222-3p 与CDK19 的靶向关系。最后在NCI-N87 中敲低CASC2，发现其对NK 细胞的杀伤敏感性显著提高，当敲低CASC2 的同时过表达CDK19，NK 细胞杀伤敏感性则与未处理组相比无明显变化；在NCI-N87细胞中敲低miR-222-3p 时NK 细胞杀伤敏感性显著降低，在敲低CASC2 同时过表达CDK19，NK 细胞杀伤敏感性则与未处理组相比无明显变化。由此可知，CDK19 受CASC2 和miR-222-3p 调控进而影响NK细胞杀伤敏感性。

综上，CDK19 在胃癌肿瘤组织及细胞系中异常高表达，受上游lncCASC2/miR-222-3p 调控，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，且促进IL-6、IL-8 表达，进而抑制胃癌NK细胞杀伤敏感性。