黄芪注射液通过抑制EMT过程中pERK1/2信号通路减轻肺纤维化①

肖 雪 李 龙 （兰州大学第一临床医学院，兰州 730000）

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）病因未明，以肺间质纤维化改变为主要表现，预后极差，目前治疗策略疗效有限。其病理特征为成纤维细胞活化、肺泡毛细血管单元破坏和细胞外基质过度沉积，导致肺异常修复，最终引起肺纤维化［1］。此过程中纤维化生长因子，尤其是TGF-β1 发挥重要作用，可诱导肺成纤维细胞发生上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），成为表达α-SMA 的肌成纤维细胞，导致大量细胞外基质（Ⅰ型胶原是其主要成分）沉积。黄芪注射液有益气养元、扶正祛邪、养心通脉、健脾利湿的功用，因其免疫调节及抗炎作用可用于过敏性气道炎症治疗。最近一项研究表明，黄芪多糖具有抗小鼠心肌纤维化作用［2］，但其在TGF-β1 诱导的肺纤维化中的作用及机制尚不明确。本研究旨在阐明TGF-β1 诱导的肺成纤维细胞EMT 过程中，黄芪注射液对pERK1/2信号通路的影响及其抑制肺纤维化的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 黄芪注射液购自上海新亚药业高邮有限公司，国药准字：Z32021257；小鼠肺成纤维细胞L-929 购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；TGF-β1 购自Multisciences（lianke）biotech.co.，LTD；β-ACTB、α-SMA、Ⅰ型胶原（CollagenⅠ）正反向引物购自上海生工生物工程股份有限公司；RTPCR 相关试剂购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；内参β-actin、一抗（pERK1/2 抗体）及二抗（兔抗鼠-HRP）均购自上海易汇生物科技有限公司；蛋白提取试剂盒及SDS-PAGE 凝胶快速配制试剂盒购自大连美仑生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 采用含10%FBS和1%青霉素链霉素混合物的DMEM 完全培养基培养小鼠肺成纤维细胞L-929，0.25%胰蛋白酶消化，37 ℃、5%CO2培养，传至第3~4 代用于实验。L-929 细胞分为5 组：对照组（完全培养基培养24 h）、模型组（完全培养基加入5 ng/ml TGF-β1 刺激24 h）、3 个治疗组（完全培养基加入5 ng/ml TGF-β1，再各加入100、200、300 mg/ml黄芪注射液）。前期为明确本研究治疗组实验浓度额外加入2 个黄芪注射液组（500、700 mg/ml）培养24 h。

1.2.2 形态学观察 倒置相差显微镜观察各组细胞形态变化，并拍照记录。

1.2.3 RT-PCR 检测α-SMA、CollagenⅠmRNA 表达 RNAex 提取细胞总RNA，超微量核酸蛋白测定仪鉴定纯度及浓度。采用Evo M-MLV 反转录试剂预混液进行反转录，反应条件为37 ℃15 min，85 ℃5 s。引物由上海生工公司合成，序列见表1。取反转录所得DNA 模板2µl进行PCR 反应，反应条件为95 ℃30 s，1 个循环，95 ℃5 s 和60 ℃30 s，共40 个循环。采用实时荧光定量PCR 仪，以小鼠ACTB 为内参，检测各组样本Ct值。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 pERK1/2 蛋白检测 采用含PMSF 的裂解液裂解细胞，提取蛋白，BSA 法测定562 nm 处吸光度，根据标准曲线及稀释倍数计算各组样品蛋白浓度。取80 µl 蛋白加入20 µl 上样缓冲液中（4∶1），100 ℃水浴变性，进行SDS-PAGE 凝胶电泳（浓缩胶80 V，浓缩胶100 V），转至PVDF 膜（180 mA，30 min），封闭120 min，将β-actin 和ERK1/2 一抗在4 ℃下摇床振荡孵育过夜，二抗在室温下孵育12 min，ECL 发光，多功能成像仪显影，Image J 软件分析目的蛋白及内参条带灰度值。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0软件进行统计学分析。所有计量资料符合正态分布且方差齐性，采用±s表示。多组间比较采用单因素ANOVA 方差分析，组间比较采用Bonferroni 检验。P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芪注射液对L-929 细胞形态的影响 倒置相差显微镜下观察小鼠肺纤维细胞L-929，对照组细胞生长状态良好，细胞贴壁较牢，细胞间较牢固连接，呈多星形或梭形，边界清晰，大小均一，呈单层“铺路石样”排列，胞核较大，轮廓清晰，核仁大而清楚（图1A）；与对照组相比，模型组细胞形态变化不大，仅细胞密度增多，细胞间隙变窄（图1B）；治疗低、中、高剂量组细胞形态无明显变化（图1C~E）；而额外加入的两个浓度组细胞收缩和变圆，细胞体变小，细胞间隙增宽，细胞核模糊，随着黄芪注射液浓度升高，漂浮死亡细胞越多（图1F、G）。

图1 各组L-929细胞形态观察（×400）Fig.1 Observation on morphology of L-929 cells in each group（×400）

2.2 黄芪注射液降低α-SMA、CollagenⅠmRNA 表达 与对照组（1.00±0.05，1.00±0.01）相比，模型组2 种基因表达升高（1.97±0.03，1.88±0.00，P<0.05），治疗低剂量组2 种基因表达升高（1.62±0.03，1.64±0.02，P<0.05）；治疗中剂量组2 种基因表达升高（1.33±0.02，1.43±0.00，P<0.05），治疗高剂量组2 种基因表达升高（1.16±0.01，1.21±0.00，P<0.05）。与模型组相比，治疗低、中、高剂量组2种基因表达均降低（P<0.05，图2）。

图2 RT-PCR 检测小鼠肺成纤维细胞中α-SMA 和Colla⁃gen Ⅰ表达Fig.2 Expression of α-SMA and Collagen Ⅰin mice lung fibroblasts detected by RT-PCR

2.3 黄芪注射液降低pERK1/2 蛋白表达 与对照组（1.00±0.00）相比，模型组pERK1/2 蛋白表达升高（1.65±0.02，P<0.05），治疗低、中、高剂量组表达降低（0.67±0.01，0.44±0.03，0.11±0.00，P<0.05）。与模型组相比，治疗低、中、高剂量组pERK1/2 蛋白表达降低（P<0.05，图3）。5组间差异均具有统计学意义（F=267.515，P<0.05）。

图3 Western blot 检测各组小鼠肺成纤维细胞pERK1/2表达Fig.3 Western blot to detect expression of pERK1/2 in lung fibroblasts of mice in each group

3 讨论

肺纤维化是一种慢性进展性疾病，可由环境因素、药物、治疗手段、疾病原因及遗传导致，但多数肺纤维化患者病因未知，称为特发性间质性肺炎，属于间质性肺疾病，而IPF 是最常见的特发性间质性肺炎。IPF 的特征为炎症细胞浸润、成纤维细胞增生和胶原蛋白沉积，最终导致肺功能不可逆转损害。由于缺乏针对IPF 的有效药物，患者确诊后寿命仅为2~5 年。两种FDA 批准的药物（吡非尼酮和尼达尼布）仅能改善肺功能却无法治愈肺纤维化［3］，因此，进一步明确IPF 的机制有助于新药开发。本研究形态学实验结果显示，模型组L-929 细胞加入TGF-β1 后有明显促增殖现象，而治疗组L-929 细胞形态与对照组差异无统计学意义。为明确合理给药剂量，本课题组前期在治疗组外设置两个更高的黄芪注射液剂浓度组（TGF-β1+黄芪注射液500、700 mg/ml），显微镜下发现，过高浓度的黄芪注射液可引起肺成纤维细胞死亡，因此得出超过300 mg/ml的黄芪注射液可能会引起肺损害的结论，故确定本研究治疗组浓度分别为：100 mg/ml（低剂量组）、200 mg/ml（中剂量组）、300 mg/ml（高剂量组）。

TGF-β1是公认的最强纤维化刺激因子，在调节炎症、细胞生长和组织纤维化中起重要作用。ERK1/2 是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）超家族成员，是普遍表达的亲水性非受体蛋白，参与Ras-Raf-MEK-ERK 信号转导通路，可通过磷酸化各种胞浆或核目标多样化和放大信号，介导途径激活的复杂生物学结果。TGF-β1 处理小鼠肾小球系膜细胞（mesangial cells，MCs），可激活内质网应急和促进MCs 增殖，同时激活ERK1/2 信号通路，而抑制ERK1/2信号通路可减弱上述作用延迟肾纤维化，提示TGF-β1 可促进ERK1/2 通路激活［4］。最新研究证实，下调TGF-β1 介导的ERK1/2 通路水平可抑制肺成纤维细胞增殖和ECM 沉积［5］。提示TGF-β1 介导的ERK1/2 信号通路是肺纤维化的潜在治疗靶标。本研究模型组结果显示，与对照组相比，TGF-β1 诱导的L-929细胞α-SMA、CollagenⅠ基因表达、pERK1/2通路表达升高（P<0.05），证明TGF-β1 可使小鼠肺成纤维细胞发生EMT，转化为肌成纤维细胞并产生细胞外基质，pERK1/2通路水平在TGF-β1诱导后显著升高，体现出TGF-β1的促纤维化作用。

黄芪注射液主要成分为黄芪，黄芪用于疾病治疗已有两千多年历史，在免疫调节、抗衰老、减弱胰岛素抵抗和抗纤维化等方面具有巨大治疗潜力，且副作用小［6］。席雪琴等［7］研究表明，黄芪的主要成分对肺癌具有抑制作用。现代药理学研究发现，黄芪能抑制腹膜间皮细胞和PD 大鼠模型EMT，揭示了黄芪在预防或治疗腹膜纤维化中的潜在治疗作用［8］。既往研究报道，黄芪注射液可能通过抑制TGF-β1/Smad 通路活化，抑制肺纤维化发展［9］。但黄芪注射液是否对肺成纤维细胞有抗纤维化作用，是否通过EMT 过程影响pERK1/2 信号通路，目前国内外相关报道较少。

为明确上述疑问，本研究发现，黄芪注射液对TGF-β1 诱导的肺成纤维细胞EMT 过程有明显抑制作用。RT-PCR 结果显示，与模型组对比，治疗组α-SMA、CollagenⅠmRNA 表达均降低（P<0.05），表明黄芪注射液可减弱TGF-β1 诱导的肺纤维化过程。黄芪多糖是从黄芪根中提取的活性成分，可通过降低ERK1/2 信号通路表达促进人肝癌HepG2 细胞凋亡［10］。与该研究结果一致，本研究Western blot结果显示，与模型组对比，低、中、高治疗组随黄芪注射液浓度升高，pERK1/2 信号通路水平降低（P<0.05）。此外，量效关系分析显示，随着治疗组加入黄芪注射液终浓度升高，α-SMA、CollagenⅠmRNA表达及pERK1/2 蛋白表达均显著降低（P<0.05），说明黄芪注射液抗纤维化作用具有浓度依赖性，本实验中黄芪注射液终浓度为300 mg/ml 时抗纤维化作用最强。

综上，本研究探讨了黄芪注射液对TGF-β1 诱导的小鼠肺成纤维细胞纤维化过程的保护作用及机制，结果表明，黄芪注射液可减轻肺纤维化，其抗纤维化作用通过下调pERK1/2 信号通路水平、抑制TGF-β1 诱导的EMT 过程中α-SMA 和CollagenⅠ基因表达实现，为临床肺纤维化治疗提供了基础资料，并为科学研究提供了新思路及理论基础。